Norme industriali per la produzione di vaccino contro la peste viva secca. Vaccino vivo contro la peste secca (Vaccinum pestosum vivum). Utilizzare rigorosamente come prescritto dal medico per evitare complicazioni

Sin dai tempi delle prime epidemie di peste, i praticanti hanno discusso se fosse possibile contrarre o meno la peste da un paziente e, in caso affermativo, in che modo. Le opinioni erano contraddittorie. Da un lato, si sosteneva che toccare i malati e le loro cose fosse pericoloso. D'altra parte, la vicinanza ai malati, l'essere nella zona infetta erano considerati sicuri. Non c'era una risposta chiara, poiché strofinare il pus del paziente sulla pelle o indossare i suoi vestiti non sempre portava all'infezione.

Molti medici hanno visto un legame tra peste e malaria. Il primo esperimento sull'autoinfezione da peste fu condotto nella città di Alessandria nel 1802 dal medico inglese A. White. Voleva dimostrare che la peste poteva provocare un attacco di malaria. White ha rimosso il contenuto purulento del bubbone di un malato di peste e lo ha strofinato sulla sua coscia sinistra. Anche quando un carbonchio è apparso sulla sua stessa coscia ei linfonodi hanno cominciato a gonfiarsi, il medico ha continuato a sostenere che aveva la malaria. Solo l'ottavo giorno, quando i sintomi si sono manifestati, si è diagnosticato la peste ed è stato portato in ospedale, dove è morto.

È ormai chiaro che la peste si trasmette principalmente da persona a persona da goccioline trasportate dall'aria Pertanto, i pazienti, in particolare la forma polmonare della peste, rappresentano un grande pericolo per gli altri. Inoltre, l'agente patogeno della peste può entrare nel corpo umano attraverso il sangue, la pelle e le mucose. Sebbene la causa della malattia per molto tempoè rimasto poco chiaro, i medici hanno cercato a lungo modi per proteggere terribile malattia. Molto prima dell'inizio dell'era degli antibiotici, con l'aiuto dei quali oggi la peste viene curata con successo, e hanno offerto vaccinazioni vari modi aumentare la resistenza del corpo alla peste.

L'esperimento condotto nel 1817 dal medico austriaco A. Rosenfeld si concluse tragicamente. Ha assicurato che un farmaco preparato con polvere di ossa e ghiandole linfatiche essiccate prelevate dai resti di coloro che sono morti a causa della peste, se assunto per via orale, protegge completamente dalla malattia. In uno degli ospedali di Costantinopoli, Rosenfeld si è rinchiuso in un reparto con venti malati di peste, avendo precedentemente assunto il farmaco da lui pubblicizzato. All'inizio è andato tutto bene. Le sei settimane previste per l'esperimento stavano volgendo al termine e il ricercatore stava per lasciare l'ospedale quando improvvisamente si ammalò forma bubbonica peste, dalla quale morì.

L'esperimento del medico russo Danila Samoilovich si è concluso con maggior successo. Il suo collega ha fumigato la biancheria di un uomo morto di peste con polveri velenose. Dopo questa procedura, Samoylovich ha messo la biancheria intima sul suo corpo nudo e l'ha indossata per un giorno. Samoilovich credeva giustamente che "un inizio ulceroso vivente" (cioè parlando lingua moderna, l'agente eziologico della peste) deve morire per fumigazione. L'esperimento ha avuto successo, Samoilovich non si è ammalato. Quindi la scienza, cento anni prima della scoperta di Yersin, ha ricevuto una conferma indiretta che l'agente eziologico della peste è un microrganismo vivente.

La ricerca di mezzi per prevenire e curare la peste è continuata. Yersen ha preparato il primo siero terapeutico anti-peste. Dopo l'iniezione di siero nei malati, la peste procedette in forma più lieve, il numero deceduti diminuito. Prima dell'apertura farmaci antibatterici questo vaccino era il principale agente terapeutico nel trattamento della peste, ma nella forma più grave, polmonare, della malattia, non ha aiutato.

Nel 1893-1915 Vladimir Khavkin, allievo dell'Università di Novorossijsk, lavorò in India. Nel 1896, a Bombay, organizzò un laboratorio in cui creò il primo vaccino anti-peste ucciso al mondo e lo testò su se stesso. Il nuovo vaccino aveva effetti sia terapeutici che profilattici. Dopo la vaccinazione, l'incidenza è stata ridotta della metà e la mortalità di quattro. Le vaccinazioni con il vaccino Khavkin sono ampiamente utilizzate in India. Fino agli anni '40, il vaccino di Khavkin rimase essenzialmente l'unica cura per la peste. Nel 1956 sono trascorsi 60 anni dalla creazione del laboratorio anti-peste (dal 1925 - l'Istituto batteriologico Khavkin). A questo proposito, il presidente dell'India Prasad ha osservato: “Noi in India siamo molto in debito con il dottor Vladimir Khavkin. Ha aiutato l'India a sbarazzarsi delle epidemie di peste e colera.

Nel nostro paese, lo sviluppo di vaccini vivi contro la peste iniziò nel 1934 con la ricezione di M.P. Pokrovskaya di un nuovo ceppo vaccinale trattando una coltura dell'agente patogeno della peste con batteriofagi. Dopo aver testato il vaccino sugli animali, Pokrovskaya e il suo collega si sono iniettati per via sottocutanea 500 milioni di microbi di questa coltura indebolita del bacillo della peste. Il corpo degli sperimentatori ha reagito bruscamente all'introduzione di microrganismi "estranei" aumentando la temperatura, peggiorando condizione generale, la manifestazione della reazione nel sito di iniezione. Tuttavia, dopo tre giorni tutti i sintomi della malattia sono scomparsi. Avendo così ricevuto un "inizio di vita", il vaccino iniziò ad essere utilizzato con successo nell'eliminazione di un focolaio di peste in Mongolia.

Allo stesso tempo, sulle isole di Giava e Madagascar, anche gli scienziati francesi L. Otten e G. Girard stavano lavorando alla creazione di un vaccino vivo. Girard è riuscito a isolare un ceppo del microbo della peste, che ha perso spontaneamente la sua virulenza, cioè ha cessato di essere pericoloso per l'uomo. Lo scienziato ha chiamato il vaccino basato su questo ceppo con le iniziali della ragazza morta in Madagascar, da cui è stato isolato - EV. Il vaccino si rivelò innocuo e altamente immunogenico, pertanto il ceppo EV è ancora oggi utilizzato per la preparazione di un vaccino vivo antipeste.

Un nuovo vaccino contro la peste è stato creato da V.P. Smirnov, che ha partecipato all'eliminazione di 24 focolai locali di peste fuori dal nostro paese. Sulla base di numerosi esperimenti su animali da laboratorio, ha confermato la capacità del microbo della peste di causare una forma polmonare della malattia quando viene infettato attraverso la congiuntiva dell'occhio. Questi esperimenti hanno costituito la base per lo sviluppo di metodi congiuntivali e combinati (sottocutanei-congiuntivali) di vaccinazione contro la peste. Per verificare l'efficacia del metodo da lui proposto, Smirnov si fece un'iniezione nuovo vaccino e allo stesso tempo si infettò con un ceppo virulento della forma più pericolosa, polmonare, della peste. Per la purezza dell'esperimento, lo scienziato ha rifiutato categoricamente il trattamento. Il sedicesimo giorno dopo l'autoinfezione, ha lasciato il reparto di isolamento. Secondo la conclusione della commissione medica, Smirnov soffriva della forma bubbonica della pelle della peste. Gli esperti hanno affermato che la proposta di V.P. Smirnov, i metodi di vaccinazione si sono dimostrati efficaci. Successivamente, nella Repubblica popolare mongola, durante l'eliminazione di un focolaio di peste, 115.333 persone furono vaccinate con questi metodi, di cui solo due si ammalarono.

Gruppo farmacologico:
Vaccino MIBP

Indicazioni:
Prevenzione della peste.

Effetti collaterali:
Il vaccino è debolmente reattivo. Le vaccinazioni possono essere accompagnate da reazioni sia locali che generali, la cui intensità dipende da caratteristiche individuali vaccinato.

Nome internazionale:

Vaccino contro la peste (Vaccino contro la peste)

Nome depositato:

Vaccino vivo contro la peste secca (Vaccinum pestosum vivum siccum)

Modulo per il rilascio:

liofilizzato per preparazione di soluzioni per somministrazione sottocutanea, intradermica, cutanea e per via inalatoria (fiale) 2 ml

Descrizioni:

Il vaccino vivo contro la peste secca è una sospensione di batteri vivi del ceppo vaccinale del microbo della peste EV NIIEG liofilizzato in un terreno di gelatina di saccarosio con tiourea o in un terreno di gelatina di saccarosio con glutammato di sodio, tiourea e peptone o in un terreno di lattosio-destrina terreno con tiourea e acido ascorbico. Il preparato secco, visto ad occhio nudo, dovrebbe apparire come una massa porosa bianco-grigiastra o giallastra e non contenere impurità estranee. Dopo aver aggiunto una soluzione di NaCl allo 0,9% (isotonica) o una soluzione di lattosio al 10%, il farmaco dovrebbe dissolversi entro 3 minuti. con la formazione di una sospensione omogenea. Il vaccino è destinato alle vaccinazioni preventive contro la peste.

Indicazioni:

Indicazione per l'esecuzione vaccinazioni preventiveè la presenza di epizoozie della peste tra i roditori o la possibilità che l'infezione venga importata da una persona malata.

Regime di dosaggio:

Metodi di somministrazione - il vaccino viene utilizzato per via sottocutanea con ago o metodo senza ago, intradermico - con metodo senza ago o per via cutanea. Lo stesso lotto di vaccino può essere utilizzato per qualsiasi metodo di vaccinazione a seconda della diluizione. Le vaccinazioni vengono effettuate dai medici nel rispetto di tutte le regole di asepsi. Sotto la supervisione di un medico, le vaccinazioni possono essere effettuate presso le postazioni feldsher-ostetrica e feldsher da paramedici e infermieri esperti che hanno ricevuto istruzioni speciali. Il medico è responsabile della corretta selezione delle persone da vaccinare. Prima della vaccinazione, i vaccinati vengono attentamente esaminati con la misurazione della loro temperatura. La vaccinazione a una temperatura di 37 gradi C e oltre è vietata. Tutti i bambini soggetti a vaccinazione devono essere esaminati tenendo conto dei dati anamnestici (malattie pregresse, tollerabilità delle vaccinazioni precedenti, presenza di reazioni allergiche medicinali, generi alimentari, ecc.). I bambini con malattie croniche, condizioni allergiche, ecc., che vivono in zone rurali, devono essere esaminati da un medico prima della vaccinazione. I bambini che frequentano gli istituti prescolari e le scuole devono essere informati in anticipo dai genitori del giorno delle imminenti vaccinazioni. È severamente vietato effettuare vaccinazioni a domicilio, ad eccezione degli allevamenti di transumanza in territorio enzootico da peste, dove la vaccinazione contro la peste viene effettuata da apposite squadre di vaccinatori sotto la guida di un medico in autovettura appositamente attrezzata o in una delle abitazioni della popolazione locale. È vietato effettuare vaccinazioni e ricevere pazienti nella stessa stanza. La presenza di malattie pustolose nel personale medico che effettua le vaccinazioni è inaccettabile. Prima di effettuare vaccinazioni di massa, ogni serie di vaccini deve essere pre-testata su un gruppo di persone di 50-100 persone, equivalente per età e stato di salute al contingente principale di vaccinati. In futuro, il vaccino può essere utilizzato per la vaccinazione di massa se il numero di reazioni medie e forti all'introduzione non supera rispettivamente il 29 e il 5%, per la somministrazione sottocutanea e intradermica, l'1% di reazioni medie per il metodo cutaneo. Quando si effettuano le vaccinazioni, si deve tenere presente che le vaccinazioni sottocutanee e intradermiche provocano una reazione post-vaccinazione più pronunciata rispetto a quella cutanea, pertanto, i contingenti sani della popolazione dai 7 ai 60 anni che non hanno controindicazioni possono essere vaccinati per via sottocutanea e intradermica metodi, e i bambini dai 2 ai 7 anni, le persone di età superiore ai 60 anni, le donne nella prima metà della gravidanza e le donne che allattano devono essere vaccinate solo per via cutanea. I contingenti sani dai 18 ai 60 anni di età possono essere vaccinati con metodi intradermici e sottocutanei senza ago senza controindicazioni.

Diluizione e somministrazione del vaccino . Prima di iniziare le vaccinazioni, l'ampolla (fiala) viene attentamente esaminata prima e dopo la diluizione. Il vaccino non deve essere utilizzato se nel bicchiere si riscontrano crepe, scaglie o sedimenti che non si rompono se agitati, così come in presenza di impurità, scaduto, senza etichette e con informazioni mancanti sulle etichette. Un'ampolla adatta viene pulita con un batuffolo di cotone con alcool e il suo collo viene limato con una lima, anch'essa precedentemente pulita con alcool. Nel caso di confezionamento del vaccino in flaconcini, dopo aver tolto la capsula metallica, la parte esterna del tappo di gomma viene trattata con alcool. Quindi, utilizzando una siringa munita di ago, si fora il tappo di gomma e si inietta il solvente. 1-2 ml di solvente vengono iniettati nell'ampolla (flacone) (a seconda del volume del vaccino versato). Se è necessaria una maggiore diluizione, la sospensione risultante viene aspirata con una siringa sterile con ago lungo e trasferita in flaconcini con il volume richiesto di soluzione sterile di NaCl allo 0,9% (isotonica) secondo le istruzioni sull'etichetta. Questo tiene conto del volume di soluzione isotonica aggiunta all'ampolla per dissolvere il vaccino. Con il metodo cutaneo di vaccinazione viene utilizzata una soluzione allo 0,9% (isotonica) di NaCl in fiale, con modalità di somministrazione intradermica e sottocutanea, a causa dei grandi volumi di diluizione, in fiale. La combinazione del contenuto di più fiale in un flaconcino è consentita solo in caso di vaccinazione mediante iniettore senza ago. Il vaccino viene diluito prima della vaccinazione, coperto con cotone idrofilo sterile o garza e utilizzato entro 2 ore, i resti vengono distrutti mediante bollitura. Per le vaccinazioni vengono utilizzate siringhe, aghi e piume di vaiolo, che vengono pre-sterilizzate a caldo secco per 1 ora a 160 gradi C (per siringhe in vetro resistente al calore) o in autoclave (30 minuti a 1,5 atm) , o facendo bollire non meno di 45 min. Il tempo viene calcolato dal momento in cui viene raggiunta la temperatura o pressione corrispondente. Ogni vaccinato deve ricevere una siringa, un ago o una penna sterilizzati separatamente. Nella siringa deve essere aspirata una sola dose di vaccinazione. È vietato utilizzare siringhe, aghi e piume vaccinate con il vaccino BCG.

Metodo della pelle . Per l'applicazione cutanea, il vaccino viene diluito con una soluzione di NaCl allo 0,9% (isotonico) nel volume indicato sull'etichetta della confezione del vaccino e lasciato direttamente nell'ampolla o flaconcino. Per un adulto, una dose umana contiene 3 miliardi di microbi vivi per 0,15 ml. La pelle nel sito di iniezione viene disinfettata con alcool; la pelle fortemente contaminata viene pre-pulita con benzina. Il vaccino viene vaccinato sulla superficie interna dell'avambraccio sinistro o sulla superficie esterna della spalla. Viene effettuata la vaccinazione nel seguente modo: con una piuma di vaiolo, lo strato superficiale dell'epidermide viene leggermente raschiato via (fino all'arrossamento) su una, due, tre (a seconda dell'età dell'innesto) aree della pelle, che viene precedentemente pulita, come indicato sopra . La distanza tra le sezioni è di 3-4 cm, l'area di ciascuna di esse è di 1-1,5 cm2. Una goccia del vaccino viene applicata su ciascuna area della pelle scarificata con una pipetta, dopodiché vengono praticate 8 tacche lineari trasversalmente con una penna per vaiolo attraverso ciascuna goccia. Quindi, per alcuni secondi, strofinalo accuratamente sulla pelle scarificata. Le tacche dovrebbero essere poco profonde, poiché un eccessivo sanguinamento da esse elimina parzialmente il vaccino.

metodo di iniezione sottocutanea . Una persona dose per vaccinazione sottocutanea contiene 300 milioni di microbi vivi in ​​0,5 ml. Quando si eseguono vaccinazioni, agitare la fiala prima di ogni set di vaccino in una siringa. Il vaccino viene iniettato nella zona della schiena sotto l'angolo della scapola rigorosamente sotto la pelle o nella spalla sinistra dietro il muscolo deltoide. La pelle prima dell'introduzione del vaccino viene trattata allo stesso modo della vaccinazione cutanea. Dopo l'iniezione, il posto viene lubrificato con tintura di iodio al 5%.

Metodo sottocutaneo senza ago . Se è necessario effettuare vaccinazioni di massa contro la peste per bambini dai 7 anni e adulti fino a 60 anni, la vaccinazione sottocutanea può essere effettuata con un iniettore senza ago. La sterilizzazione di tutte le parti dell'iniettore viene effettuata mediante ebollizione per almeno 45 minuti. o in autoclave a temperature fino a 130 gradi C per 30 minuti. Una singola sterilizzazione garantisce la sterilità dell'iniettore per 24 ore. A cambio frequente fiale con il vaccino, in caso di flusso continuo di persone o interruzioni forzate nel processo di vaccinazione di massa, l'iniettore viene sottoposto a ulteriore sterilizzazione di 70 gradi. alcool. Per evitare la coagulazione dei residui di vaccino nell'iniettore, la fiala con il farmaco viene sostituita con una fiala con acqua distillata sterile e i canali della testa dell'iniettore vengono lavati con 10-15 "spruzzi", osservando le precauzioni per prevenire l'inquinamento ambientale da parte del ceppo vaccinale del microbo della peste e misure per proteggere i vaccinatori dall'inalazione dell'aerosol del vaccino a causa del pericolo di allergia. Quindi, allo stesso modo, l'iniettore viene sterilizzato con alcool. Si consiglia di posizionare la fiala con il vaccino sull'iniettore immediatamente prima che l'iniezione venga somministrata al vaccinato. Prima di ciò, i residui di alcol devono essere rimossi con acqua distillata e il volume del vaccino somministrato deve essere regolato sulla scala dell'iniettore in base all'età della persona da vaccinare. Le fiale tappate per la diluizione del vaccino vengono sterilizzate con calore secco per 1 ora a 160 gradi C e conservate per non più di 3 giorni. La preparazione, la procedura operativa e il controllo delle condizioni tecniche dell'iniettore vengono eseguiti rigorosamente in conformità con descrizione tecnica e le istruzioni per l'uso. La vaccinazione con un iniettore senza ago viene eseguita secondo le istruzioni per il suo uso per iniezioni sottocutanee di farmaci in un volume di 0,5 ml. Il volume del farmaco somministrato varia a seconda dell'età della persona vaccinata (vedi sotto). Iniettare il vaccino solo nella regione deltoidea. Il sito di iniezione viene trattato allo stesso modo del metodo di vaccinazione con ago.

Metodo senza ago intradermico . La vaccinazione con un iniettore senza ago viene eseguita secondo le istruzioni per il suo utilizzo per iniezioni intradermiche di farmaci in un volume di 0,1 ml. Tuttavia, una dose umana contiene 300 milioni di microbi vivi. Il vaccino viene somministrato rigorosamente per via intradermica nella spalla sinistra dietro il muscolo deltoide. La pelle prima dell'introduzione del vaccino viene trattata allo stesso modo di altri metodi di vaccinazione. Le vaccinazioni intradermiche senza ago sono accompagnate in quasi tutti i casi da lieve dolore e reazione infiammatoria nel sito di iniezione. Subito dopo l'iniezione, sulla pelle appare una papula con un diametro fino a 10 mm sotto forma di una "crosta di limone", che si risolve dopo 1-2 ore Dopo 6-10 ore compaiono iperemia e gonfiore, che raggiungono un'intensità massima (fino a 2,5 cm di diametro - reazione debole, fino a 5 cm - reazione media, oltre 5 cm - reazione forte) dopo 24-48 ore e poi, diminuendo gradualmente di dimensione, scompare dopo 6-7 giorni. In alcuni individui, al centro del rigonfiamento può comparire una papula densa con passaggio a una pustola con contenuto bianco-grigiastro, che poi si ricopre di una crosta che cade dall'8° al 10° giorno dopo la vaccinazione. Al suo posto rimane una delicata cicatrice, che successivamente scompare. I metodi intradermici e sottocutanei inoculati devono essere osservati dal punto di vista medico entro un'ora dall'immunizzazione, poiché nei casi più rari può verificarsi uno shock in individui particolarmente sensibili.

La frequenza e la frequenza delle vaccinazioni . Il vaccino viene somministrato una volta. Fornisce immunità che dura fino a 1 anno. Con vaccinazioni praticate annualmente degli stessi contingenti della popolazione, la rivaccinazione viene effettuata dopo 12 mesi. La vaccinazione della popolazione adulta viene effettuata non prima di 1 mese, bambini - non prima di 2 mesi dopo la vaccinazione con altri vaccini. La vaccinazione degli adulti con altri farmaci può essere effettuata non prima di 1 mese e dei bambini - non prima di 2 mesi dopo l'inoculazione con il vaccino contro la peste.

Dimensioni delle dosi primarie. Per la vaccinazione e la rivaccinazione vengono utilizzate le dosi: per adulti e bambini vaccinati di età superiore ai 14 anni, la dose del vaccino (microbi vivi) con la via di somministrazione sottocutanea è di 300 milioni in 0,5 ml; con intradermico - 300 milioni in 0,1 ml; per applicazione cutanea - 3 miliardi in 0,15 ml (3 gocce di un contagocce). Bambini di età compresa tra 10 e 14 anni - con la via di somministrazione sottocutanea - 1/2 dose per adulti in 0,3 ml; per applicazione cutanea - 3 miliardi in 0,15 ml (3 gocce di un contagocce). Bambini di età compresa tra 7 e 10 anni - con sottocutanea - 1/3 dose per adulti in 0,15 ml; cutanea - 2/3 dosi in 0,1 ml (2 gocce). Bambini da 2 a 7 anni con la via di somministrazione cutanea - 1/3 dose in 0,05 ml (1 goccia).

Effetti collaterali:

La normale reazione del corpo alla somministrazione del farmaco. Le vaccinazioni con vaccino vivo contro la peste secca possono essere accompagnate da una reazione generale e locale, la cui intensità dipende, oltre che dalle caratteristiche individuali del vaccinato, dal metodo di vaccinazione. Le inoculazioni cutanee sono accompagnate principalmente da una reazione locale, che si esprime nella comparsa di edema, iperemia, una piccola eruzione vescicolare lungo le incisioni e talvolta infiltrazione nel sito dell'inoculazione. La linfangite e la linfoadenite regionale sono meno comuni. La reazione locale inizia a manifestarsi dopo 8-10 ore e raggiunge il pieno sviluppo dopo 24-30 ore, in più casi rari- 48 ore dopo la vaccinazione. Reazione generale nella maggior parte dei casi è insignificante o assente e può essere accompagnato da un aumento della temperatura entro 1 giorno fino a 37,5 gradi C, nell'1% dei vaccinati la temperatura può salire da 37,6 a 38,5 gradi C (reazione media). Una reazione locale alle vaccinazioni sottocutanee e intradermiche è accompagnata da diffusa iperemia, gonfiore e in quasi tutti i casi c'è dolore. Meno comunemente, i linfonodi regionali si ingrossano. La reazione locale inizia a svilupparsi dopo 6-10 ore, raggiunge il pieno sviluppo dopo 24-48 ore, scompare dopo 4-5 giorni. La reazione generale si esprime in malessere, mal di testa, febbre fino a 37,5 gradi C (reazione debole), da 37,6 a 38,5 gradi C (media), da 38,6 gradi C e oltre (forte). Medio e forti reazioni può essere osservato nel 29 e 5%, rispettivamente, di numero totale vaccinato. In rari casi si verificano nausea e vomito. La reazione generale si verifica in 1-2 giorni e di solito scompare 1-3 giorni dopo la vaccinazione. Per prevenire reazioni generali e locali, si consiglia di assumere acido acetilsalicilico 1,0 g tre volte il primo e due volte il secondo e il terzo giorno, nonché difenidramina 0,05 go tavegil 1 compressa (0,001) due volte per 3 giorni.

Possibili complicazioni durante la somministrazione del farmaco e la fornitura dell'assistenza necessaria al paziente in caso di complicanze. In rari casi, l'introduzione del vaccino contro la peste è accompagnata da reazioni significative di locale e generale. In caso di eccessive reazioni locali si consiglia la somministrazione per via orale antistaminici(Dimedrol 0,05 - 0,1). In caso di shock o sintomi di una reazione anafilattoide nei vaccinati con metodo sottocutaneo, si raccomanda la somministrazione sottocutanea di 1 ml di adrenalina (1: 1000) o 1 ml di efedrina al 5% o mezaton (1% - 1,0). Somministrazione endovenosa di 1 - 3 ml di una soluzione al 10% di cloruro di calcio, 20 - 25 ml di soluzione di glucosio (20 - 40%), prednisalone (40 - 140 mg in 200 - 500 ml di poliglucina), 0,9% ( isotonico) soluzione di NaCl con l'aggiunta di 0,3 - 0,5 ml di adrenalina (1: 1000), nonché l'uso di ossigeno, cordiamina, corazol, caffeina e altri agenti sintomatici.

Controindicazioni:

Le controindicazioni per l'uso sono: malattie infettive acute. Dopo il trasferimento malattie acute le vaccinazioni devono essere effettuate non prima di 1 mese dopo recupero clinico. sopravvissuti all'epatite infettiva infezione meningococcica le vaccinazioni vengono effettuate non prima di 6 mesi dopo il recupero; forme attive di tubercolosi e reumatismi; malattie del sistema cardiovascolare(difetti cardiaci scompensati e subcompensati, ipertensione di II e III grado, infarto del miocardio); ulcera peptica e duodeno; tagliente e malattie croniche reni, fegato e cistifellea; forme gravi tireotossicosi, diabete, insufficienza surrenalica e altre malattie sistema endocrino; malattie del sangue e del sistema linfoide (anemia maligna e pronunciata, leucemia, diatesi emorragica); asma bronchiale, bronchite asmatica, diatesi essudativa e altri condizioni allergiche, reazioni anafilattiche a cibo, farmaci e altri allergeni; forme gravi di rachitismo e malnutrizione (II e III stadio); malattie della pelle durante manifestazioni cliniche(eczema, neurodermite, foruncolosi, comune malattie pustolose pelle); seconda metà della gravidanza; neoplasie maligne, lupus eritematoso e altre collagenosi; affilato stato pronunciato infantilismo; malattia sistema nervoso; infortunio con effetti residui, epilessia con frequenti convulsioni, idrocefalo nella fase di scompenso e subcompensazione e altre malattie del sistema nervoso centrale; trattamento con steroidi, antimetaboliti, radioterapia (le vaccinazioni sono consentite non prima di 6 mesi dopo la fine della terapia in assenza di altre controindicazioni).

Data di scadenza:

La durata di conservazione del vaccino essiccato in terreno di gelatina di saccarosio con tiourea è di 2 anni, seguiti da ricontrollo ed estensione per un altro anno, in terreno di gelatina di saccarosio con acido glutammico sodico, tiourea e peptone - 3 anni dal momento di asciugatura, con ricontrollo dopo 3 e 5 anni e prorogandolo ogni volta per altri 2 anni; in terreno lattosio-destrina con tiourea e acido ascorbico dopo controllo di vitalità dopo 6 mesi dalla data di produzione, viene fissata una shelf life fino a 5 anni, seguita da ricontrollo ed estensione per altri 2 anni.

Condizioni di archiviazione:

Il vaccino viene conservato in un luogo buio e asciutto a una temperatura compresa tra -20 e + 6 gradi C. A temperatura ambiente(20 - 25 gradi C) il vaccino può essere conservato fino a 2 mesi, compreso il periodo di trasporto.

I titolari del brevetto RU 2510825:

L'invenzione si riferisce al campo della biotecnologia e riguarda un metodo per produrre una preparazione a base di un ceppo vaccinale di un microbo della peste. La presente invenzione prevede la produzione di una coltura nativa di un microbo della peste, la concentrazione di una sospensione microbica, la preparazione di una sospensione di vaccino e la preparazione di una forma secca del farmaco, mentre la preparazione di una coltura di coltura include la coltivazione di microbi in mezzo nutritivo liquido in bottiglia per 48 ore ad una temperatura di 26...28°C e aerazione continua di almeno 10 l min -1 con una coltura starter stabilizzata passivata ottenuta a seguito di tre passaggi consecutivi attraverso il corpo porcellini d'India e miscelato in rapporto 2:1 con un liquido stabilizzante glicerolo-lattosio-poliglucina, nella preparazione di una sospensione vaccinale si utilizza un mezzo di essiccazione protettivo ottimizzato in termini di composizione dei componenti e si effettua la liofilizzazione osservando determinata modalità. La soluzione presentata ti consente di ottenere un prodotto con maggiore attività riducendo al contempo la durata del processo di produzione. 3 ill., 6 tab.

L'invenzione si riferisce al campo della biotecnologia, vale a dire ai metodi per ottenere preparati batterici a base di ceppi vaccinali del microbo della peste, e può essere utilizzata per la preparazione di preparati medici immunobiologici.

Attualmente, in Russia, l'unico farmaco utilizzato per prevenzione specifica peste, è un vaccino vivo contro la peste secca sviluppato nel 1937-1939. basato sul ceppo vaccinale EV della linea NIIEG [Faibich M.M., Karneev R.V., 1947]. Uso a lungo termine il vaccino contro la peste live dry le ha mostrato alta efficienza con metodi di immunizzazione cutanea, intradermica, sottocutanea e inalatoria.

Tuttavia, il problema di preservare le proprietà altamente immunogeniche del vaccino è in gran parte determinato dalla stabilità delle proprietà biologiche del ceppo vaccinale del microbo della peste, che ne fa parte, non solo nel processo conservazione a lungo termine ma anche nelle fasi tecnologiche della produzione di droga. Le serie di vaccini prodotte, come dimostra la pratica, possono differire l'una dall'altra in termini di proprietà fisico-chimiche, contenuto di cellule microbiche vive, stabilità termica, umidità residua, immunogenicità e altri indicatori. Pertanto, la ricerca di nuovi modi per ottenere vaccini contro la peste che migliorino le loro caratteristiche qualitative è un compito urgente nella fase attuale.

Un metodo noto per produrre un vaccino vivo contro la peste secca basato sul ceppo EV della linea NIIEG, utilizzato nell'Istituto di ricerca di Stavropol [Regolamento industriale. Numero di registrazione FGUN GISK loro. LA. Tarasevich PR n. 2334-09]. Il metodo consiste nella preparazione sequenziale di colture di semi di I...III generazione da una coltura liofilizzata industriale del ceppo vaccinale EV: generazione I - coltivazione in provetta su Hottinger slant agar, generazione II - in materassini (flaconi) con Hottinger brodo o brodo a base di idrolizzato di caseina enzimatica (FGK ), III generazione - coltivazione in un mezzo nutritivo liquido (ZHMS) in bottiglie, coltivazione di una coltura nativa su un mezzo nutritivo denso (DMS) in AKM-Sh (reattore), preparazione di un vaccino sospensione e una preparazione secca.

Il più vicino a quanto affermato è un metodo per produrre un vaccino contro la peste vivo in polvere basato sul ceppo di vaccino EV utilizzato nell'Istituto centrale di ricerca 48 del Ministero della difesa della Russia [Norme industriali per la produzione di vaccino contro la peste vivo liofilizzato per sospensione iniettabile, inalazione e applicazione di scarificazione della pelle. PR 08461522-07-08. Approvato il 06/03/2009 Numero di registrazione della FGUN GISK da cui prende il nome. LA. Tarasevich PR n. 2120-09]. Il metodo consiste nella preparazione sequenziale di colture di semi di I...III generazione dalla coltura di produzione del ceppo vaccinale EV: generazione I - coltivando microbi in provette su PPS inclinato a base di idrolizzato enzimatico di carne bovina (MGF), II generazione - MGF basata su MGF in fiale, III generazione - coltivazione in ZhPS a base di MGF in bottiglie, coltivazione di colture native in ZHPS, in dispositivi - coltivatori (reattori), concentrazione di sospensione microbica, preparazione di sospensione vaccinale mediante essiccazione protettiva mezzo della seguente composizione:

liofilizzazione della sospensione vaccinale secondo il seguente regime tecnologico:

temperatura del condensatore - meno (50…70)°C;

temperatura di congelamento del materiale - meno 30°C;

rarefazione nella camera di essiccazione - non più di 300 micron di mercurio;

velocità di asciugatura - 2°С·h -1 ;

tempo di asciugatura -10 h.

In comune con il metodo rivendicato c'è la somiglianza di ottenere una coltura di semi coltivando in JPS a base di MGF in bottiglie e concentrando una sospensione microbica.

I principali svantaggi del metodo del prototipo sono i seguenti.

1. Ottenimento di un inoculo tradizionale, che comprende una serie di subcolture successive su terreni nutritivi solidi e liquidi (colture da inoculo di I, II, III generazione), che non garantiscono la stabilità delle principali proprietà biologiche e riducono significativamente la resistenza del ceppo vaccinale del microbo della peste all'azione di fattori esterni nelle successive fasi di preparazione di una sospensione concentrata, sospensione vaccinale e forma secca del prodotto finito.

2. L'uso della destrina come componente dell'ambiente protettivo per l'essiccazione, che, a causa dei processi di coagulazione e ulteriore sedimentazione, provocati dall'esposizione alta temperatura durante la sterilizzazione in autoclave, porta ad un aumento artificiale della densità ottica rispetto all'originale. Ciò contribuisce ulteriormente all'inadeguatezza della valutazione della concentrazione effettiva, l'aumento della concentrazione ottica delle cellule microbiche direttamente nella preparazione del vaccino. Le circostanze di cui sopra portano a una diminuzione indesiderata di uno degli indicatori più importanti della qualità del vaccino vivo contro la peste: la percentuale di cellule microbiche vive.

3. L'uso della modalità tradizionale di essiccazione della sospensione vaccinale con un'elevata morte di microbi in condizioni di stress liofilo.

Tutte le suddette carenze richiedevano una seria ricerca dello schema ottimale per la preparazione dell'inoculo, che garantisse la stabilizzazione delle principali proprietà biologiche dei microbi su fasi iniziali produzione di vaccini, ottimizzazione della composizione dei componenti del mezzo di essiccazione per una protezione completa delle cellule microbiche prima della liofilizzazione ed eliminazione di possibili errori tecnici nella determinazione della concentrazione di cellule microbiche nella fase di preparazione della sospensione vaccinale, sviluppo di modalità di liofilizzazione che riducono la effetto dannoso basse temperature e disidratazione delle cellule microbiche durante il processo di essiccazione.

Scopo dell'invenzione è ridurre la durata del processo di ottenimento di un preparato vaccinale con contestuale incremento della sua attività specifica.

Il problema è risolto grazie al fatto che nel metodo dichiarato per ottenere un vaccino sviluppato e ottimizzato (tabella 1):

1. Schema per l'ottenimento di una coltura di semi di un ceppo di un microbo della peste, che prevede la coltivazione di una coltura starter stabilizzata passivata (PSSC) in JPS in bottiglia.

Per preparare il PSSC, un'ampolla con una coltura di riferimento di un ceppo microbico della peste viene risospesa al suo volume originale in acqua distillata, quindi vengono eseguiti tre successivi passaggi testicolari della coltura microbica attraverso il corpo di animali sensibili (cavie). La coltura microbica passivata viene isolata sterilmente dal corpo degli animali e miscelata in rapporto 2:1 con un liquido stabilizzante (glicerolo, lattosio e poliglucina). Il PSSC preparato, destinato all'ottenimento di una coltura di semi in flaconi, viene versato in fiale da 60...80 ml e conservato congelato ad una temperatura di meno 18...22°C.

La coltura dei microbi in JPS in bottiglia viene effettuata per 48 ore a una temperatura di 26...28°C e un'aerazione continua di almeno 10 l·min -1 . Al termine della coltivazione viene effettuato un controllo biologico della coltura che viene trasferita al reattore per la preparazione di una coltura autoctona.

Le caratteristiche comparative delle colture native del ceppo vaccinale del microbo della peste, preparate secondo lo schema dichiarato e lo schema prototipo, sono presentate nella tabella 2.

2. Composizione dei componenti dell'ambiente protettivo per l'essiccazione: lattosio, g·l -1 - 300,0; tiourea, g l -1 - 30,0; acido ascorbico, g l -1 - 30,0; poliglucina, g 1 -1 - 30,0; acqua distillata, l - fino al volume calcolato, il pH del mezzo è compreso tra 7,4 ... 7,8 unità. pH (tabella 3).

La poliglucina (agente che forma la struttura del polisaccaride) è un destrano domestico ottenuto per sintesi diretta. Il peso molecolare della poliglucina è (50...70)·10 3 unità. Essendo un prodotto di idrolisi parziale della destrina, ha proprietà identiche, ma è significativamente inferiore nel peso molecolare. La poliglucina è chimicamente inerte, praticamente non si combina con altre sostanze. L'innocuità, la non tossicità e l'apirogenicità della poliglucina sono state dimostrate dal suo uso a lungo termine e di successo nel campo delle trasfusioni di sangue. L'assenza di effetti collaterali sul corpo umano ne consente l'uso come componenti del mezzo di essiccazione per i vaccini.

La sua azione sulle cellule microbiche si basa sul processo di stabilizzazione dello stato conformazionale delle molecole proteiche dovuto al ripristino dei legami idrogeno intramolecolari. L'uso della poliglucina come crioprotettore può ridurre significativamente la distruzione delle cellule microbiche durante il congelamento e la disidratazione durante la liofilizzazione.

3. Modalità tecnologica di liofilizzazione secondo i parametri principali: temperatura del condensatore meno 60°C, temperatura di congelamento del materiale meno 40°C, rarefazione nella camera di essiccazione (profondità del vuoto) non superiore a 100 µm Hg, velocità di essiccazione 3°C h - 1, tempo di asciugatura 6 ore (Tabella 3, Figure 1-3).

Ridurre la durata del processo di produzione del vaccino, stabilizzare le proprietà biologiche del microbo della peste nelle fasi di preparazione dei semilavorati del vaccino e migliorare caratteristiche qualitative forma secca del farmaco a causa di:

1) uno schema per ottenere una coltura di semi di un ceppo vaccinale di un microbo della peste, che prevede la coltivazione di PSSC in JPS in bottiglia;

2) l'utilizzo di un mezzo essiccante protettivo ottimizzato in termini di composizione dei componenti;

3) modalità di liofilizzazione ottimizzata rispetto ai principali parametri tecnologici.

La relazione causale tra gli insiemi di caratteristiche essenziali dell'oggetto rivendicato e i risultati raggiunti è presentata nella tabella 4.

EFFETTO: l'invenzione consente di preparare un vaccino che soddisfi i requisiti e abbia proprietà biologiche stabili per tutta la durata di conservazione consentita.

La possibilità di realizzare l'invenzione rivendicata è mostrata dal seguente esempio.

Per la preparazione della coltura di semina del microbo della peste, la PSSA conservata a temperature negative viene aggiunta allo ZhPS in bottiglia a base di MGF. La coltivazione viene effettuata per 48 ore ad una temperatura di 26...28°C ed aerazione continua di almeno 10 l·min -1 . Al termine della coltivazione della coltura in bottiglia, viene controllata biologicamente e trasferita in reattori per la preparazione di una coltura autoctona. La coltivazione della sospensione microbica nel reattore viene effettuata con il metodo della coltivazione profonda in conformità con i requisiti della [Normativa industriale. Numero di registrazione FGUN GISK loro. LA. Tarasevich PR n. 2120-09].

Per preparare il mezzo essiccante, una porzione pesata di poliglucina viene prima versata in 100...200 ml di acqua distillata calda 40...50°C e mantenuta per 10...12 ore ad una temperatura di 18...24 °C. La soluzione omogenea risultante viene filtrata in un contenitore sterile attraverso un filtro a garza.

Un campione di lattosio viene versato in 500 ml di acqua distillata e riscaldato a 80...90°C sotto costante agitazione fino a completa dissoluzione. Successivamente, la soluzione risultante è divisa in due parti. Sciogliere in una parte acido ascorbico, e nell'altro - tiourea; la dissoluzione della tiourea viene effettuata ad una temperatura di 70...80°C. Una soluzione di acido ascorbico viene neutralizzata con una soluzione di NaOH al 40% ad un valore di 7,3 ... 7,5 unità. pH. Le soluzioni preparate di tiourea e acido ascorbico vengono filtrate attraverso un filtro a garza e miscelate con una soluzione di poliglucina. Il valore del pH della miscela risultante dovrebbe essere compreso tra 7,2 e 7,6 unità. pH. Il valore del pH viene regolato con una soluzione di NaOH al 10%.

Per correggere la densità ottica nella preparazione della sospensione vaccinale, si prepara anche soluzione aggiuntiva mezzo di essiccazione con un contenuto di componenti 10 volte inferiore al loro contenuto nella soluzione principale del mezzo di essiccazione. Il mezzo di essiccazione risultante viene sterilizzato in un'autoclave (vapore scorrevole - 40 min; a 120°C - 20 min o filtrazione su unità filtranti come "Sartorius" SM 16277 o "Sartokon-mini").

In una bottiglia con una sospensione concentrata del microbo della peste, utilizzando un vuoto, aggiungere il mezzo di essiccazione al tasso di 2:1 (2 parti della sospensione concentrata, 1 parte del mezzo di essiccazione). Il contenuto della bottiglia viene accuratamente miscelato agitando. Successivamente, viene prelevato un campione della sospensione vaccinale nella quantità di 200 ... 300 ml per valutarne le proprietà biologiche. La sospensione del vaccino può essere conservata a una temperatura di 2 ... 6 ° C per non più di 4 ore.

La sospensione vaccinale viene versata in fiale sterili di penicillina da 2,0 ml ciascuna utilizzando un erogatore automatico sopra la fiamma di una lampada ad alcool.

L'essiccazione per sublimazione viene eseguita in un'unità TG-16. Per fare ciò, 3 ore prima del caricamento, i ripiani della camera vengono raffreddati ad una temperatura di meno 40°C, il condensatore ad una temperatura di meno 60°C. Le cuvette con fiale sono installate su 1-5 ripiani del sublimatore. Un sensore di temperatura è inserito in una delle bottiglie sui ripiani n. 1, 3, 5. Il congelamento della sospensione vaccinale viene effettuato ad una temperatura di meno 40°C. Dopo aver raggiunto la temperatura specificata, la sospensione del vaccino viene conservata per 2 ore. Trascorsa 1 ora dalla creazione di un determinato valore di vuoto, viene attivato il riscaldamento dei ripiani. Successivamente, effettuare un aumento graduale della temperatura fino a 0°C. Il tasso di essiccazione durante questo periodo è di 3°C·h -1 . Quando la temperatura nel materiale raggiunge 0°C, viene portata ad una temperatura di 25–30°C in 6 ore riscaldando i ripiani. La velocità di asciugatura durante questo periodo è di 5…6°C h -1 e l'asciugatura finale viene effettuata a questa temperatura per 6 ore.

Le caratteristiche comparative dei lotti di produzione sperimentale del vaccino vivo contro la peste secca, sviluppato secondo il metodo dichiarato e il metodo prototipo, nonché durante la conservazione a lungo termine, sono presentate nelle tabelle 5 e 6.

Metodo per produrre una preparazione basata su un ceppo vaccinale di un microbo della peste, che comporta la realizzazione di una coltura nativa del microbo della peste, la concentrazione della sospensione microbica, la preparazione di una sospensione vaccinale e l'ottenimento di una forma secca della preparazione, caratterizzata dal fatto che la preparazione della coltura del seme comprende la coltivazione di microbi in un mezzo nutritivo liquido in bottiglie per 48 h a una temperatura di 26 ... 28 ° C e un'aerazione continua di almeno 10 l min -1 con una coltura starter stabilizzata passivata ottenuta a seguito di tre passaggi successivi attraverso il corpo delle cavie e miscelato in un rapporto di 2: 1 con un liquido stabilizzante glicerolo-lattosio-poliglucina, quando si prepara una sospensione vaccinale, viene utilizzato un mezzo di essiccazione protettivo ottimizzato in termini di composizione dei componenti, tra cui: lattosio , g l -1 - 300,0, tiourea, g l -1 - 30,0, acido ascorbico, g l -1 - 30,0; poliglucina, g 1 -1 - 30,0; acqua distillata, l - fino al volume calcolato, pH del mezzo è 7,4 ... più di 100 µm Hg, velocità di asciugatura 3°C h -1 e tempo di asciugatura finale 6 ore.

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L'invenzione si riferisce alla biotecnologia. Il metodo per ottenere materiale di spore di batteri del genere Clostridium comporta l'ottenimento di un inoculo di batteri in un mezzo nutritivo sintetico completo, l'inoculo dell'inoculo e la coltivazione in condizioni adeguate in un mezzo nutritivo comprendente patate, glucosio, solfato di ammonio e gesso.

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MINISTERO DELLA SALUTE DELLA FEDERAZIONE RUSSA

AUTORIZZAZIONE FARMACOPIE

Vaccino vivo contro la peste FS.3.3.1.0022.15

INsostituzioni GF X, art. 713

FS 42-3877-99

Questa monografia si applica a un vaccino vivo contro la peste, un liofilizzato per la preparazione di una sospensione per iniezione, scarificazione cutanea e inalazione, che è una coltura viva del ceppo vaccinale del microbo della peste Yersinia pestis Linea EV NIIEG, essiccata per liofilizzazione in mezzo stabilizzante.

Il vaccino è destinato alla prevenzione della peste e provoca lo sviluppo di un'immunità specifica che dura fino a 1 anno.

PRODUZIONE

Ceppo vaccino Y. pestis La linea EV NIIEG dovrebbe avere tipicità morfologiche, culturali e proprietà biochimiche; contengono plasmidi pFra, pesticinogenicità (pPst) e dipendenza da calcio (pCad) con pesi molecolari» 60 , » 6 e » 47 MDa, rispettivamente; non dovrebbe causare la morte delle cavie e la perdita del loro peso se somministrato a una dose di 15 10 9 cellule microbiche (MC). L'immunogenicità del ceppo in termini di ED 50 quando somministrato per via sottocutanea non deve superare 10 3 mk per cavie, 10 4 mk per topi bianchi.

Prima di preparare il prossimo lotto di ceppo vaccinale Y. pestis Le linee NIIEG EV lo passano attraverso il corpo di una cavia con successiva selezione di colonie tipiche cresciute su piastre Petri con Hottinger agar da milza e colture regionali. linfonodi.

La tecnologia di produzione del vaccino prevede la produzione di colture di semina Y. pestis Linee EV NIIEG I, II e III generazione; il processo di accumulo della biomassa coltivata per la preparazione della sospensione vaccinale con la concentrazione richiesta; successivo imbottigliamento, congelamento, liofilizzazione, sigillatura e confezionamento del farmaco. Nelle fasi di preparazione delle colture di semi, vengono determinati il ​​​​PH, la concentrazione di cellule microbiche e l'assenza di microflora estranea.

A seconda della tecnologia di preparazione del vaccino, nel processo di produzione vengono utilizzati eccipienti approvati per l'uso nella produzione di prodotti immunobiologici. medicinali: saccarosio, gelatina, tiourea, destrina, acido ascorbico.

PROVE

Descrizione

Massa porosa di colore bianco-grigiastro.

Autenticità

Il vaccino deve contenere una coltura pura del ceppo vaccinale Y. pestis Linea EV NIIEG. La determinazione viene eseguita con il metodo dell'immunofluorescenza utilizzando immunoglobuline fluorescenti diagnostiche della peste, in conformità con le istruzioni per l'uso. Negli strisci della preparazione, le cellule microbiche dovrebbero emettere una luce verde brillante intorno alla periferia.

Tempo di dissoluzione

Dovrebbe dissolversi completamente entro 3 minuti con l'aggiunta di 1,8 ml di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.

La preparazione ricostituita è una sospensione bianco-grigiastra omogenea senza impurità e scaglie estranee. La determinazione viene eseguita visivamente.

Stabilità del tempo di sedimentazione

La sospensione non deve separarsi entro 5 minuti. La determinazione viene effettuata in conformità con.

Dimensione delle particelle

La sospensione deve passare liberamente nella siringa attraverso l'ago n. 0840. La determinazione viene eseguita in conformità con.

pH

Dal 6,8 al 7,8. La determinazione viene effettuata con il metodo potenziometrico secondo. Per il test utilizzare 5 campioni.

Perdita all'essiccamento

Non più del 4,0%. La determinazione viene effettuata con il metodo gravimetrico secondo. Per il test utilizzare 5 campioni.

Peso medio e scostamento dal peso medio

Il coefficiente di variazione della massa del vaccino in fiale (flaconi) non deve essere superiore al 5%. La determinazione viene effettuata in conformità con.

Assenza di microrganismi e funghi estranei

Il vaccino non deve contenere microrganismi e funghi estranei. La determinazione viene eseguita secondo il metodo dell'inoculazione diretta su terreno tioglicolico.

2 ml di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% vengono aggiunti all'ampolla (flaconcino) con il vaccino. 1 ml di ciascun campione della sospensione risultante viene inoculato in provette contenenti 20 ml di terreno tioglicolico. Una provetta di ciascun campione viene incubata a una temperatura compresa tra 30 e 35 °C per rilevare microrganismi aerobi e anaerobi, l'altra a una temperatura compresa tra 20 e 25 °C per rilevare i funghi. Dopo 5-7 giorni, 0,5 ml di ciascuna provetta vengono inoculati in 2 provette contenenti 10 ml di terreno tioglicolico e incubate alle temperature sopra indicate. Dopo 14 giorni di coltura dal giorno dell'inoculazione primaria, si effettuano strisci da tutte le provette, colorate secondo Gram, osservate al microscopio con un ingrandimento di K7 × 40.

Se si trovano cocchi o bastoncini gram-positivi in ​​​​almeno uno dei 10 campi visivi visualizzati, il farmaco è considerato contaminato da microflora estranea.

Se vengono rilevati bastoncini gram-negativi in ​​​​strisci che differiscono nella morfologia dal microbo della peste, vengono preparati strisci, che vengono colorati con immunoglobuline fluorescenti diagnostiche della peste secondo le istruzioni per l'uso e visualizzati in ogni striscio almeno 10 campi utilizzando un microscopio a fluorescenza . Se non tutti i batteri trovati nel vaccino emettono uno specifico bagliore verde brillante alla periferia della cellula, si considera che il farmaco abbia fallito il test.

Sicurezza specifica

Il vaccino deve essere sicuro. Il test viene eseguito su una cavia del peso di (275 ± 25) g.

Il contenuto dell'ampolla (fiala) viene sciolto in 1,8 ml di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, la concentrazione viene determinata secondo il metodo descritto nella sezione "Attività specifica (concentrazione di cellule microbiche)", diluita con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% ad una concentrazione di 15 10 9 mc/ml e iniettato per via sottocutanea in un volume di 1 ml a una cavia durante superficie interna fianchi.

Il giorno 6, la cavia viene pesata, soppressa e vengono annotati i cambiamenti patoanatomici rilevati all'autopsia. Il fegato, la milza, i polmoni, i linfonodi regionali, il sangue e i tessuti dal sito di iniezione vengono seminati con il metodo dell'impronta su una capsula di Petri con Hottinger agar, pH (7,2 ± 0,1), con l'aggiunta di solfito di sodio 0,25 g per 1 litro di terreno e su piastra Petri con Hottinger agar, pH (7,2 ± 0,1), con l'aggiunta di viola di genziana 0,05 g per 1 litro di terreno. Le inoculazioni vengono incubate ad una temperatura di (27 ± 1) oC per 3 giorni.

Il vaccino non dovrebbe causare una perdita di peso in una cavia di oltre il 20% entro 6 giorni dalla somministrazione, non dovrebbe causare cambiamenti patologici visibili nei polmoni - emorragie, focolai di infiammazione, granulomi, ascessi; nelle colture ematiche e polmonari non dovrebbe esserci crescita del microbo della peste. Nel sito di iniezione è consentito lo sviluppo di emorragia e infiltrazione. tessuto sottocutaneo trasformandosi in necrosi. Negli organi interni (milza e fegato) è consentito lo sviluppo di una reazione nodulare limitata.

Attività specifica

1. Concentrazione di cellule microbiche. La preparazione deve contenere da 5 10 10 a 10 11 mc. in 1 ml. La determinazione viene effettuata su 3 campioni per ciascuna serie. Le fluttuazioni nei risultati delle determinazioni nei singoli campioni non devono superare il 5% del valore medio aritmetico.

Il contenuto dell'ampolla (fiala) viene sciolto in 1,8 ml di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. 0,1 ml della preparazione diluita vengono aggiunti a una provetta standard e viene aggiunta una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% fino a raggiungere la concentrazione del campione standard (DS) di torbidità (10 UI). Il volume della soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% utilizzato per la diluizione viene preso in considerazione nel calcolo della concentrazione di cellule microbiche (CC) secondo la formula:

va bene = (0,1 + N) ·10,

0,1 è il volume del vaccino disciolto, ml;

Nè il volume della soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% utilizzato per diluire il campione, ml;

10 è un valore costante.

1. Numero di cellule microbiche viventi. Il numero di cellule microbiche viventi dovrebbe essere almeno il 25% del numero totale di cellule microbiche. Le fluttuazioni nei risultati della determinazione nei singoli campioni non devono superare il 20% del valore medio aritmetico.

Per determinare il numero di cellule microbiche vive nel vaccino, vengono utilizzate pipette e provette pulite chimicamente con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, che deve essere raffreddata a una temperatura compresa tra 2 e 8 ° C.

Per determinare il numero di cellule microbiche vive, si effettuano successive diluizioni decuplicate da 10 -1 a 10 -8 da campioni di sospensioni di vaccini precedentemente preparati, utilizzando una pipetta separata con una capacità di 1 ml per ciascuna diluizione. Dalle provette con diluizioni di 10 -7 e 10 -8, 0,1 ml di sospensione vengono seminati con una pipetta per 2 piastre Petri con un mezzo nutritivo per isolare e coltivare il microbo della peste o con Hottinger agar con uno stimolatore della crescita (sangue emolizzato a concentrazione 1%) o solfito di sodio (0,25 g per 1 litro di terreno).

Dopo 72 - 96 ore di incubazione alla temperatura di (27 ± 1) °C, si conta il numero di colonie per ogni campione, prendendo come 100% il numero di cellule microbiche inoculate, in base all'indicatore della concentrazione totale di microbi cellule per questo campione, determinate utilizzando lo standard di torbidità (10 ME). Per il numero di cellule microbiche vitali per ciascuna serie, viene presa la media aritmetica delle determinazioni per 3 fiale (fiale).

Sulla base del numero di cellule microbiche vitali nell'ampolla (fiala) con il vaccino, vengono calcolati il ​​numero di dosi e il volume del solvente di ciascuna serie per la preparazione di una sospensione iniettabile, la scarificazione della pelle e l'inalazione.

Per l'affidabilità dei risultati ottenuti, viene utilizzato in parallelo un campione standard del vaccino vivo contro la peste.

1. Immunogenicità. Il vaccino ED 50 per cavie non deve superare 10 4 per topi bianchi - 4 10 4 cellule microbiche vive. Il test viene eseguito su cavie del peso di (275 ± 25) g e su topi bianchi non lineari del peso di (19 ± 1) g Il vaccino viene diluito in modo che 1 ml contenga 10 9 m.k. Sulla base di un numero predeterminato di MC vivi, il vaccino viene diluito per immunizzare le cavie a concentrazioni di 2 x 10 5 ; 4 10 4 ; 8 10 3 e 16 10 2 m.c./ml; topi bianchi - fino a concentrazioni di 5 10 5 ; 1 105; 2 10 4 e 4 10 3 mc/ml. Ogni dose del farmaco viene somministrata una volta a 6 animali. Le cavie sono immunizzate per via sottocutanea nella superficie interna della coscia sinistra in un volume di 0,5 ml; topi bianchi - in un volume di 0,2 ml in dosi di 8 10 2, 4 10 3, 2 10 4 e 1 10 5 vivi m.k.

Per determinare il contenuto effettivo di cellule microbiche vive nelle dosi immunizzanti, una sospensione contenente 8 × 10 3 mc/ml, utilizzata nell'immunizzazione delle cavie, o una dose di 4 × 10 3 mc/ml per l'immunizzazione dei topi bianchi, viene diluito ad una concentrazione di 10 3 mc/ml. 0,1 ml di una sospensione con una concentrazione di 103 mc/ml (100 mc) vengono seminati su 3 piastre Petri con uno dei suddetti mezzi nutritivi e incubati a una temperatura di (27 ± 1) ° C per 48 ore. le colonie cresciute sulle piastre vengono prese in considerazione nel calcolo dell'ED 50 della serie di test.

L'infezione sottocutanea delle cavie viene effettuata nella superficie interna della coscia destra il 21° giorno, i topi - nella stessa area il 7° o 21° giorno dopo l'immunizzazione. La dose infettiva per gli animali immunizzati con il vaccino è di 200 Dcl (Dosis certa letalis = LD 100) di un ceppo virulento del microbo della peste, di cui 1 Dcl non deve superare le 100 cellule microbiche.

Preparazione del ceppo infettante Y. pestis 231 deve essere specificato nella documentazione normativa.

Per infettare animali (di controllo) non immunizzati si utilizza una sospensione con una concentrazione di 50 mc/ml in un volume di 0,5 ml per le cavie e di 125 mc/ml in un volume di 0,2 ml per i topi bianchi, che corrisponde a 1 Dcl.

Per determinare il contenuto effettivo di cellule microbiche del ceppo infettante, 0,1 ml di sospensione di coltura Y. pestis 231, contenente 10 3 MK/ml, vengono seminati su 3 piastre Petri con Hottinger agar e distribuiti uniformemente su tutta la superficie del terreno mediante il metodo delle tazze "running". Le inoculazioni vengono incubate a una temperatura di (27 ± 1) ºС per 48 ore, dopodiché viene contato il numero di colonie cresciute.

L'osservazione degli animali infetti viene effettuata per 20 giorni. Tutti gli animali di controllo devono morire di peste entro 10 giorni. Gli animali morti vengono sezionati, vengono prelevati organi e tessuti (nelle cavie vengono prelevati campioni dal sito di iniezione, linfonodi inguinali regionali, fegato, milza, polmoni, apice del cuore; nei topi bianchi - dalla milza), seminandoli con il metodo dell'imprinting su piastre Petri con Hottinger agar con aggiunta di violetta di genziana e con Hottinger agar - con solfito di sodio. Le piastre Petri vengono incubate a (27 ± 1) ºС. I risultati vengono registrati dopo 24-48 ore.

Solo quegli animali sono considerati morti dalla peste, dai cui organi viene rilasciata la cultura durante la semina Y. pestis.

ED 50 è calcolato dalla formula:

lg ED 50 = lg D N- S · (∑ l io - 0,5),

LG D N è il logaritmo della massima dose immunizzante (effettiva);

Sè il logaritmo della molteplicità delle diluizioni;

l i è il rapporto tra il numero di animali sopravvissuti all'immunizzazione con una data dose e totale animali a cui è stata somministrata questa dose;

∑L i - somma di valori l ho trovato per tutte le dosi testate.

Se tutti gli animali di controllo sono sopravvissuti, o se il valore di ED 50 è più che accettabile, il controllo viene ripetuto sullo stesso numero di animali. Se il valore ED 50 è superiore al valore consentito durante la ripetizione del test, si considera che il farmaco abbia fallito il test.

stabilità termica

Almeno 4 giorni. L'indice di stabilità termica (il periodo durante il quale il 50% delle cellule microbiche vive viene trattenuto nel preparato rispetto alla quantità iniziale) viene determinato in 3 campioni dopo che il vaccino è stato conservato a una temperatura di (37 ± 1) ° C per 14 giorni.

Il metodo per determinare il numero di cellule microbiche viventi è descritto nella sezione "Attività specifica". Indice di stabilità termica ( T) al giorno è calcolato dalla formula:

LG UN 0 è il logaritmo del numero iniziale di MC/ml vivi;

LG UN n è il logaritmo del numero di mc vivi/ml dopo 14 giorni di conservazione del vaccino alla temperatura di (37 ± 1) °C;

0,3 è un valore costante;

14 – tempo di conservazione del vaccino a (37 ± 1) °C, giorni.

I dipendenti della filiale di Saratov del Centro federale di ricerca per la virologia e la microbiologia hanno studiato quali anticorpi e meccanismi della risposta immunitaria cellulare sono attivati ​​dal vaccino vivo contro la peste nell'uomo. Hanno scoperto che la presenza nel sangue dei soggetti del test di anticorpi specifici contro la proteina Pla (attivatore del plasminogeno della peste) è un indicatore affidabile del successo della vaccinazione. Scientifico pubblicato sulla rivista PLoS Malattie tropicali trascurate.

La peste è infezione causato da batteri Yersinia pestis (bacchetta della peste). L'infezione è trasmessa dalle pulci che vivono sui roditori, compresi i ratti che prosperano nelle città. In passato, la peste ha spazzato via milioni di europei. Negli ultimi decenni, il numero di casi di infezione è stato notevolmente ridotto grazie alla vaccinazione. Tuttavia, la malattia è ancora comune nei paesi in via di sviluppo. Per prevenirne la diffusione è necessario capire come funziona il vaccino contro la peste e migliorarne l'efficacia.

I biologi di Saratov hanno iniziato un lavoro su larga scala per identificare i meccanismi di azione del vaccino contro la peste viva. Per fare ciò, hanno prelevato campioni di sangue da 34 volontari di età compresa tra 26 e 72 anni, che erano stati ripetutamente vaccinati contro la peste strofinando una sospensione di microbi vivi sulla pelle particolarmente danneggiata, nonché da 17 persone sane non vaccinate della stessa età. Persone successive Il primo gruppo è stato suddiviso in coloro che erano stati vaccinati meno di un anno prima dell'esame del sangue (13 persone) e coloro che erano stati vaccinati per un anno o più prima di partecipare a questo studio (i restanti 21). Gli scienziati erano interessati allo stato dei linfociti mononucleari nel sangue dei soggetti. Queste cellule forniscono una risposta immunitaria all'invasione di vari batteri nel corpo, incluso il bacillo della peste.

I ricercatori hanno determinato in quali quantità i linfociti mononucleari di cittadini vaccinati e non vaccinati contro la peste secernono sostanze che aiutano a combattere i batteri: interferone gamma (IFN-γ), fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), nonché interleuchine 4, 10 e 17A. Prima di determinare il contenuto di queste molecole nelle cellule mononucleate, il sangue è stato purificato da tracce di vaccino vivo contro la peste - cellule Yersinia pestis e i loro frammenti. Nelle "soluzioni purificate" di linfociti mononucleari ottenute da ciascun soggetto è stata aggiunta la proteina Pla - l'attivatore del plasminogeno della peste, l'enzima del bacillo della peste, che ne favorisce la diffusione in tutto il corpo dell'infetto e sopprime risposta immunitaria SU Yersinia pestis.

Si è scoperto che i linfociti mononucleari dei vaccinati rilasciano significativamente più interleuchine 4 e 10, così come TNF-α e IFN-γ in risposta alla presenza di Pla. Le cellule del sangue di quelli vaccinati meno di un anno fa erano leggermente più attive dei linfociti di quelli vaccinati prima, ma questa differenza non era statisticamente significativa. Tuttavia, per qualche ragione, i linfociti mononucleati di soggetti non vaccinati con Pla producono 3,4 volte più interleuchina-4 rispetto a cellule simili dal sangue di soggetti vaccinati. E più volte a una persona è stato iniettato un vaccino vivo contro la peste in passato, meno interleuchina-4 è stata prodotta nell'esperimento dai suoi linfociti.

I ricercatori hanno anche determinato nel sangue dei soggetti i livelli di anticorpi di varie classi di immunoglobuline che reagiscono alla presenza dell'attivatore del plasminogeno della peste Pla. Molti di loro si legano non solo al Pla, ma anche ad altre proteine. Quando gli scienziati sono riusciti a isolare esattamente quegli anticorpi che reagiscono solo alla presenza di Pla, si è scoperto che la maggior parte di essi si forma in coloro che sono stati vaccinati relativamente molto tempo fa. Come con l'interleuchina-4, vaccinazioni multiple contro la peste hanno prodotto un minor numero di anticorpi delle sottoclassi di immunoglobuline G1 e G2 prodotte in risposta all'attivatore del plasminogeno della peste. Tuttavia, nel sangue dei vaccinati ripetutamente in presenza di Pla sono stati trovati anticorpi specifici contro questa proteina della sottoclasse delle immunoglobuline G3, mentre non sono stati trovati nei non vaccinati. Al contrario, gli anticorpi contro l'attivatore del plasminogeno della peste della sottoclasse di immunoglobuline G4 erano presenti solo nei non vaccinati.

Dai dati ottenuti, gli autori hanno concluso che la risposta immunitaria dell'organismo all'attivatore del plasminogeno della peste Pla può essere utilizzata per giudicare l'efficacia della vaccinazione, sebbene il Pla non sia l'unica sostanza prodotta dal bacillo della peste che provoca una risposta immunitaria nel corpo umano. Tuttavia, è necessario monitorare chiaramente il rilascio e l'attivazione di quali sostanze sono associate alla comparsa di Pla nel corpo e quali si verificano in modo non specifico. Gli scienziati suggeriscono anche che iniezioni multiple di un vaccino vivo contro la peste potrebbero non aumentare l'efficacia della protezione contro la peste, poiché il livello di interleuchina-4 e anticorpi delle sottoclassi di immunoglobuline G1 e G2 nel sangue diminuisce con ogni vaccinazione.