Vaccino contro l'afta epizootica dei bovini. Vaccino contro l'afta epizootica e metodo per la sua fabbricazione. Resilienza ai fattori naturali

"Tutto grazie a Dio, solo nelle mucche ... l'afta epizootica non si è ancora schiusa", scrisse Leo Tolstoj a sua moglie Sofya Andreevna da Yasnaya Polyana nel 1900. Come puoi vedere, anche allora gli animali soffrivano di questa malattia virale. E soprattutto bovini. La malattia porta con sé una diminuzione della produzione di latte e una perdita di peso delle mucche, un'elevata mortalità tra gli animali giovani. Il principale danno economico è legato alla necessità di misure di quarantena, quando milioni di capi di bestiame devono essere distrutti. Talvolta una persona viene infettata, anche se ciò accade raramente. Di norma, i bambini si ammalano dopo aver bevuto latte infetto dall'afta epizootica.

Origine virale della malattia

Descrizioni dell'afta epizootica si trovano già a metà del XVI secolo, nelle opere del medico e ricercatore veneziano D. Fracastoro. Attualmente il virus si trova negli animali non solo in Europa e Russia, ma anche nei paesi asiatici, in America e in Africa. L'ultima volta nel 2005 in Estremo Oriente tra le mucche si è verificata una forte epidemia di afta epizootica che ha oltrepassato il confine cinese. Le perdite economiche hanno poi superato i 45 milioni di rubli.

In virtù di decorso acuto e l'infettività dell'afta epizootica del bestiame, per molto tempo fu scambiata per una grande peste bestiame. Alla fine del 19 ° secolo fu scoperto il colpevole della malattia: un virus, un rappresentante della famiglia Picornaviridae. È costituito da RNA (acido ribonucleico) in un rivestimento proteico.

Nei primi due giorni dopo che il virus dell'afta epizootica è entrato nel corpo dell'animale, la sua concentrazione si verifica nell'epitelio delle vescicole aftose e nella linfa. Inoltre, si trova nei fluidi fisiologici: salivare e secrezioni sanguigne, urina e feci. Questo agente extracellulare ha 7 tipi e un gran numero di varietà.

L’epidemia tra le mucche dell’Estremo Oriente è stata causata dal virus Asia-1. Oltre a ciò, oggi nel mondo sono ampiamente utilizzati i tipi A, O e CAT-2. Un animale malato riceve l'immunità solo dal tipo con cui è stato infettato. Pertanto non sono escluse nuove infezioni di mucche con altre varietà di afta epizootica.

Resilienza ai fattori naturali

In ambiente esterno l'afta epizootica persiste a lungo. Su oggetti contaminati e nel letame animale - fino a cinque mesi. Entro 40 giorni, il microbo mantiene la sua attività anche dopo un rapido congelamento della carne di mucca. Rimane vitale nel latte fino a 50 giorni dopo la refrigerazione. Dai 30 ai 40 giorni vive di lana e vestiti.

Tuttavia, nel latte vaccino a 37 gradi il virus dell'afta epizootica non sopravvive nemmeno 12 ore. IN prodotti a base di latte fermentato anche lui muore rapidamente. L'ebollizione uccide immediatamente la sua infezione e il microrganismo può resistere a una temperatura di 60 gradi per non più di 15 minuti.

Come il virus entra nel corpo

Il microbo è trasportato da animali malati e convalescenti (portatori del virus). Una mucca malata può rappresentare un pericolo per lungo tempo, trasformandosi in custode e portatrice del virus dell'afta epizootica. Le vie di infezione più probabili sono:

• contatto con un animale infetto o guarito;
• mangime infetto da virus;
• utilizzo di latte di mucche infette;
• pascolo o abbeveratoio;
• trasferimento aerogeno di particelle di polvere infetta, mangime, secrezioni.

La fonte dell'infezione per una mucca può essere il personale addetto alla manutenzione che trasporta il virus su indumenti contaminati e articoli per la cura degli animali. Anche il trasporto utilizzato nelle aziende agricole può diventare un vettore. I diffusori passivi del contagio sono anche coloro che non sono malati, ma trasportano meccanicamente il virus, cani, gatti, Uccello domestico. Questi portatori dell'afta epizootica includono vari insetti, tra cui acari e mosche.

Come funziona il parassita

Penetrante con il cibo o attraverso pelle nel corpo di una mucca viene fissato il virus dell’afta epizootica tessuti epiteliali animale. Nello stesso luogo si moltiplica, il che porta all'inclusione reazioni infiammatorie. Dopo un giorno, i microbi iniziano a diffondersi attraverso il sangue in tutto il corpo. Stato generale peggiora bruscamente, inizia la febbre.

Il corpo infetto della mucca risponde con lo sviluppo dell'immunità, neutralizzando l'infezione negli organi e nei tessuti. Tuttavia, la pelle è la più indifesa in questa malattia, perché è la meno fornita di sangue e, quindi, di anticorpi.

Il processo può influenzare il muscolo cardiaco e i muscoli scheletrici della mucca. Il tempo per combattere questo agente patogeno è limitato.

Solo il riconoscimento tempestivo della malattia e trattamento chirurgico dall’afta epizootica può salvare il bestiame dallo sterminio completo.

Come identificare una malattia

I primi segni dell'afta epizootica sono la perdita di appetito. La temperatura sale a 40-41 gradi. Il battito cardiaco accelera. In questo momento, la malattia può essere vista sotto forma di diverse afte primarie (vescicole) delle dimensioni di un chicco di miglio sulla mucosa orale, sulle ali nasali, nella fessura dello zoccolo, sulla mammella di una mucca. Le piccole bolle si fondono in grandi bolle Noce. Scoppiando, le afte secernono linfa e formano erosioni dolorose. È difficile per un animale masticare cibo e gomme da masticare. Si sente un ticchettio, uno schiocco caratteristico dell'afta epizootica e la saliva schiumosa agli angoli della bocca.

Le eruzioni cutanee sugli zoccoli portano a zoppia, un cambiamento nell'andatura. Maggior parte tempo, le mucche affette da afta epizootica preferiscono sdraiarsi, rifiutandosi di alzarsi in piedi. Il latte cambia consistenza: diventa viscido, acquisisce un sapore amaro.

L’afta epizootica nei vitelli giovani può risolversi senza vescicole. La malattia in questo caso, nei suoi sintomi, è simile a gastroenterite acuta. Lo sviluppo della patologia può essere sia benigno che maligno. Nel secondo caso, il virus infligge danni sistema cardiovascolare animale e la malattia si manifesta con mancanza di respiro, respiro sibilante, debolezza generale.

Il miglioramento atteso all'8-12° giorno non si verifica. Il polso della mucca accelera fino a 120, disturbi funzionali sistema nervoso assumere forme estreme: paralisi, paresi. In 25-50 casi su 100 l'arresto cardiaco avviene con esito fatale.

L’erosione è una porta per le infezioni

Durante la formazione delle afte, gli animali richiedono cura speciale. Il risultato del trattamento dell'afta epizootica dipende in gran parte dalla qualità del loro contenuto. Le erosioni emergenti diventano la porta per l'infezione con un'infezione secondaria. Forse lo sviluppo di dermatiti, endometriti, artrite, broncopolmonite e altre malattie causate da streptococchi e stafilococchi. L'ostruzione dei canali del capezzolo e la mastite sulla mammella sono una delle manifestazioni dell'afta epizootica nelle mucche.

È necessario fornire agli animali lettiera igroscopica asciutta e pulita, Abbastanza acqua pulita, regolare aerazione della stanza. L'alimentazione dovrebbe essere morbida. Alle mucche viene data farina, erba e buon insilato. Gli animali vengono riposati. Le afte vengono trattate con soluzioni:

• acido acetico (2%);
• permanganato di potassio (0,1%);
• furatsilina (0,5%).

Nei casi difficili, alle mucche viene somministrata l'anestesia in modo che l'animale possa nutrirsi. Per fare ciò, le aree interessate vengono lubrificate con una composizione di anestesia, novocaina e vetriolo blu in un rapporto di 1:1:2, preparato sulla base di vaselina e olio di pesce.

Gli zoccoli di una mucca devono essere tenuti puliti, imbrattati di catrame mescolato a metà olio di pesce. Tintura di iodio o lo streptocidio con permanganato di potassio aiuterà in caso di infiammazione. A cura adeguata dopo una settimana, l'erosione si restringe.

Combattere il virus dall'interno

Il virus dell'afta epizootica è vario, quindi preparazioni speciali per il trattamento degli animali non vengono rilasciati. Le cure fornite sono principalmente finalizzate alla gestione dei sintomi. Oltre ai farmaci, viene utilizzato il trattamento esterno delle ulcere, soprattutto nei casi di infezione secondaria antibiotici moderni(cefalosporine e suoi analoghi). Per sostenere l'attività cardiaca della mucca: fondi cardiaci.

Come misura di rafforzamento generale, iniezioni endovenose glucosio o dare un bicchiere di miele. In alcuni casi, la mucca viene alimentata con il mosto attraverso un tubo. Un'importanza decisiva nel trattamento di questa malattia appartiene all'organizzazione tempestiva delle vaccinazioni.

Come proteggere gli animali dalle malattie

Nelle zone svantaggiate, per la prevenzione della patologia, viene effettuata la vaccinazione contro l'afta epizootica dei bovini. A questo scopo sono stati creati sieri iperimmune. Viene utilizzato anche un vaccino contro l'afta epizootica a base di sangue di convalescenti (portatori del virus). Se l'animale è stato vaccinato per la prima volta, entro la fine della terza settimana dopo la vaccinazione forma l'immunità e la conserva per un anno. Allo stesso tempo, la stabilità degli anticorpi nel sangue dei bovini vaccinati dura 6 mesi.La vaccinazione è uno di fattori importanti afta epizootica in Russia.Quando esiste la minaccia di infezione delle mucche e per proteggersi dalle complicazioni, le condizioni per l'allevamento degli animali vengono migliorate e viene prescritta un'alimentazione dietetica.

Le misure per combattere l'afta epizootica dipendono dalla geografia dell'epidemia, dal quadro epizootico, dalle tradizioni domestiche e da altre caratteristiche. Esistono quattro approcci a questo problema:

• rifiuto di vaccinarsi, eliminazione di tutti gli animali infetti e potenzialmente infetti (radicale);
• immunizzazione solo attorno al focolaio e distruzione degli animali nel focolaio dell’infezione;
• effettuare vaccinazioni regolari delle mucche a fini di prevenzione nelle zone di confine, l'eliminazione dei pazienti nell'epidemia e la vaccinazione attorno alla fonte dell'infezione;
• l'eliminazione del bestiame infetto in combinazione con la vaccinazione intensiva e l'organizzazione di misure di quarantena.

Il primo metodo distrugge efficacemente il virus dell'afta epizootica nella zona in cui è stato rilevato primariamente. I paesi sviluppati possono permetterselo, poiché in questi casi il danno economico ammonta a milioni di dollari. Il terzo, basato su un'immunizzazione regolare, mantiene con successo la protezione contro virus pericoloso in Russia. Scorso, metodo complesso, mira a proteggere dall'afta epizootica non solo il focolaio dell'infezione, ma anche l'intera catena epizootica. Pertanto, è riconosciuto come il più efficace e viene utilizzato nelle aree svantaggiate e di confine con esse.

In Russia esiste un programma per combattere il virus dell'afta epizootica. L'insieme delle misure comprende il monitoraggio della situazione, il controllo dei movimenti degli animali, dei prodotti degli allevamenti, combinato con la vaccinazione regolare. In caso di rilevamento dell'afta epizootica, entrano in vigore le istruzioni corrispondenti. Per ordine del governatore località O agricolturaè impostata la quarantena. A causa dell'elevata contagiosità del virus, le misure sanitarie e di quarantena adottate dal servizio veterinario devono essere rigorosamente rispettate.

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L'invenzione riguarda il campo della virologia e delle biotecnologie veterinarie e riguarda un vaccino contro l'afta epizootica di tipo A. Il vaccino contiene materiale antigenico avirulento e purificato proveniente dal ceppo virale Aphtae epizooticae, fam. Picornaviridae, genere Aphtovirus, sierotipo A, depositato nella collezione di FGU "VGNKI" sotto numero di registrazione N. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEPA N. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEPA, ottenuto in una coltura cellulare continua VNK-21, che è una sospensione contenente prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S del virus dell'afta epizootica, adiuvanti idrossido di alluminio con saponina e mezzo di supporto in rapporti efficaci. Il vaccino è altamente immunogenico e può fornire protezione efficace dall'agente eziologico dell'infezione da afta epizootica, circolante nei paesi della Transcaucasia, Asia centrale, Vicino ed Estremo Oriente. 11 w.p. f-ly, 14 tab., 1 limo, 4 pr.

Disegni del brevetto RF 2526570

L'invenzione riguarda il campo della virologia veterinaria e della biotecnologia e può essere utilizzata nello sviluppo e nella produzione di un vaccino adsorbito inattivato contro l'afta epizootica di tipo A.

L'afta epizootica è una malattia acuta contagiosa malattia virale animali artiodattili. È caratterizzato da una tendenza all'ampia distribuzione e al decorso epizootico. La malattia è accompagnata da grandi perdite di latte, carne e altri prodotti animali, ostacola le operazioni commerciali e attività economica. Garantire il benessere sostenibile del Paese in termini di afta epizootica Federazione Russaè in fase di attuazione un sistema di misure la cui priorità è la prevenzione dell'introduzione del virus dell'afta epizootica nel territorio e nelle regioni alto grado rischio - vaccinazione. Attualmente, nella Federazione Russa e nei paesi della CSI, di norma, i vaccini assorbiti inattivati ​​vengono utilizzati per l'immunizzazione dei bovini e dei piccoli ruminanti contro l'afta epizootica e i vaccini in emulsione inattivati ​​vengono utilizzati per l'immunizzazione dei suini.

La tecnologia per la produzione di un vaccino contro l'afta epizootica da un virus inattivato inizia con la selezione dei ceppi produttivi sulla base di un'analisi epidemiologica della dinamica dell'afta epizootica nel paese e nei paesi vicini. Quando si creano farmaci per prevenzione specifica vengono utilizzati tipi appropriati di virus dell'afta epizootica e vengono selezionati ceppi con un ampio spettro antigenico all'interno di un tipo con marcata immunogenicità crociata. Filtrare con un'ampia gamma L'immunogenicità e i requisiti soddisfacenti della regione vengono selezionati testandola in una reazione di protezione incrociata o, più comunemente, in una reazione di neutralizzazione incrociata. Di norma, come ceppo di produzione viene utilizzata una popolazione virale che, insieme al sistema e alle condizioni di coltivazione industriale, garantisce un accumulo elevato e garantito dei componenti 146S e 75S del virus e la produzione di un vaccino immunogenico.

Inoltre, al ceppo produttivo vengono imposti i requisiti per la stabilità del virus nel processo di purificazione dai componenti tissutali e di concentrazione, nonché la conservazione del virus durante l'inattivazione e la conservazione a lungo termine.

L'agente eziologico dell'afta epizootica presenta una significativa variabilità antigenica dei ceppi all'interno dello stesso sierotipo, che viene rilevata a diversi intervalli di tempo e in diversi territori e dipende dalla composizione delle specie del bestiame sensibile, dalla sua stato immunitario e molti altri vari fattori. La variabilità antigenica dell'afta epizootica è dovuta alle sostituzioni di aminoacidi nei frammenti polipeptidici (epitopi antigenici) esposti sulla superficie delle proteine ​​del capside. I cambiamenti nello spettro antigenico, corrispondenti al rinnovamento della struttura di un nuovo ceppo di campo, possono variare da insignificanti a rilevabili anticorpi monoclonali, a significativi, registrati utilizzando le tradizionali immunoglobuline policlonali. Cambiamenti significativi nelle caratteristiche antigeniche del ceppo naturale con altamente probabile causare indebolimento immunità specifica indotto da un antigene non omologo. Inoltre causano difficoltà nella diagnosi ceppo-specifica.

Di conseguenza, è necessario creare nuovi strumenti diagnostici e un’immunoprofilassi specifica.

Ceppi noti di afta epizootica di tipo A, utilizzati come produzione nell'URSS e nella Federazione Russa negli ultimi 50 anni.

Questi includono i seguenti ceppi: A 7 n. 103, isolato nel 1962 nella regione di Kuibyshev; A 7 n. 2, assegnato nel 1965 nella SSR tagica; A n. 717/73, assegnato nel 1973 in Territorio di Stavropol.

Questi ceppi sono stati utilizzati per ottenere diagnostici e vaccini contro l'afta epizootica utilizzati in varie regioni del Paese.

Tuttavia, dopo l’eradicazione dell’afta epizootica causata da ceppi virali antigenicamente vicini, la loro produzione è stata interrotta e attualmente sono supportati solo nella raccolta di ceppi di microrganismi dell’Istituto di bilancio dello Stato federale “ARRIAH”.

Vaccino noto inattivato adsorbito contro l'afta epizootica di tipo A, contenente il principio attivo sotto forma di materiale antigenico avirulento e purificato dal ceppo omologo dell'agente infettivo A 22 n. 550, ottenuto in un sistema biologico sensibile, e additivi mirati sotto forma di adiuvante e mezzo di supporto in un rapporto efficace.

Il ceppo A 22 n. 550 del virus dell'afta epizootica è stato isolato nel 1964 in Azerbaigian ed è utilizzato nella Federazione Russa come strumento di produzione nella realizzazione di profilassi e diagnostica specifiche utilizzate in tutta la Russia e nei paesi post-sovietici.

Vaccino adsorbito inattivato noto del ceppo A (Georgia) 1999/ virus n. 1721 dell'afta epizootica Aphtae epizooticae di tipo A, isolato nel 1999 nella Repubblica della Georgia.

Vaccino adsorbito inattivato noto proveniente dal virus dell'afta epizootica Aphtae epizooticae di tipo A del ceppo n. 1707 "Armenia-98".

Vaccino contro il virus dell'afta epizootica di tipo A del ceppo di produzione A n. 1707 "Armenia-98", utilizzato nella zona cuscinetto della Transcaucasia.

Gli svantaggi dei vaccini realizzati con questi ceppi sono l’insufficiente attività antigenica e immunogenica contro gli isolati epizootici dell’afta epizootica di tipo A attualmente circolanti nei paesi del Caucaso, dell’Asia centrale e del Medio Oriente (Turchia, Iran, ecc.) a causa delle significative differenze antigeniche esistenti. .

Il più vicino all'invenzione proposta nel complesso caratteristiche essenzialiè un vaccino adsorbito inattivato contro l'afta epizootica di tipo A, contenente il principio attivo sotto forma di materiale antigenico avirulento e purificato proveniente dal ceppo A (Georgia) 1999/n. 1721, ottenuto in un sistema biologico sensibile, e additivi mirati sotto forma di adiuvanti GOA con saponina e un mezzo di supporto nel rapporto μg:

Il ceppo A (Georgia) 1999 / n. 1721-DEP è stato isolato nel 1999 nella Repubblica di Georgia e viene utilizzato nella Federazione Russa come prodotto di produzione nella produzione di profilassi e diagnostica specifiche utilizzate in tutta la Russia e nei paesi della CSI.

Come sistema biologico sensibile viene utilizzata una coltura in sospensione di cellule VNK-21 e come mezzo di supporto viene utilizzata la soluzione di Earl senza siero con l'aggiunta di FGMS, GBCS e antibiotici a pH 7,4÷7,6.

La poliesametileneguanidina (PHMG) viene utilizzata per purificare una sospensione contenente virus dalle impurità di zavorra e l'amminoetiletilenimina (AEEI) viene utilizzata per inattivare il virus. Alla sospensione viene aggiunto tiosolfato di sodio per neutralizzare l'AEEI.

Il materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A (Georgia) 1999/n. 1721 è una sospensione prevalentemente di componenti immunogenici 146S e 75S del virus dell'afta epizootica. GOA con saponina viene utilizzato come adiuvanti.

Lo svantaggio principale dei vaccini noti, incluso il vaccino prototipo, sono le differenze antigeniche rispetto agli isolati dell'afta epizootica di tipo A isolati a diversi intervalli di tempo, e i vaccini preparati sulla base di essi forniscono una protezione efficace degli animali solo contro l'infezione da un virus omologo.

Nel 2003, in Iran è stato isolato un nuovo isolato di FMDV di tipo A, significativamente diverso dai ceppi di questo tipo precedentemente studiati. Nel periodo 2005÷2006 L'afta epizootica di tipo A si è diffusa nei paesi dell'Asia occidentale: Iran, Turchia, Arabia Saudita e Pakistan. Nel febbraio 2006, l'afta epizootica di tipo A della linea Iran/05 è entrata in Tracia, la parte europea della Turchia, al confine con Bulgaria e Grecia. La vaccinazione del 100% di tutti i ruminanti con il ceppo A 22 in Tracia nel febbraio-marzo 2006 ha impedito la diffusione dell'afta epizootica alle vicine Grecia e Bulgaria, ma dopo 3-4 mesi sono comparsi nuovi casi della malattia.

Di conseguenza, si è reso necessario un nuovo vaccino contro il sierotipo A del virus dell’afta epizootica del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 per garantire la sicurezza del territorio della Russia e degli Stati confinanti da questo agente patogeno.

Il compito di creare la presente invenzione includeva lo sviluppo di un vaccino assorbito inattivato contro l'afta epizootica dell'afta epizootica che crea una protezione efficace per gli animali sensibili contro l'afta epizootica di tipo A nei paesi del Transcaucaso, dell'Asia centrale, del Medio ed Estremo Oriente.

Il risultato tecnico derivante dall'uso della presente invenzione è quello di espandere l'arsenale di vaccini adsorbiti inattivati ​​contro l'afta epizootica di tipo A.

Il risultato tecnico specificato viene raggiunto mediante la creazione di un vaccino adsorbito inattivato contro l'afta epizootica di tipo A, caratterizzato dal seguente insieme di caratteristiche.

Il vaccino proposto contiene in 1 cm 3 della preparazione: il principio attivo sotto forma di materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP, ottenuto preferibilmente in una coltura in sospensione di cellule VNK-21 in un quantità di almeno 3,0 μg e additivi target: GOA preferibilmente nella quantità di 11.000,0÷15.000,0 µg, saponina preferibilmente nella quantità di 500,0÷1.500,0 µg e mezzo di mantenimento nella quantità fino a 1.000.000,0 µg.

Il virus originale per ottenere il ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP è stato isolato nel 2007 nella Repubblica del Kirghizistan. Il ceppo è stato ottenuto mediante molteplici passaggi successivi su colture cellulari sensibili etero- e omologhe. Il ceppo viene adattato alle cellule renali suine primarie trypsinizzate e trapiantate colture cellulari VNK-21, IBRS-2 e PSGK-30.

Per la produzione di un vaccino, come sistema biologico sensibile viene preferibilmente utilizzata una coltura in sospensione di cellule VNK-21 e come mezzo di supporto viene utilizzata la soluzione di Earl senza siero con l'aggiunta di FGMS, GBCS e antibiotici a pH 7,4÷7,8.

Per inattivare il virus si utilizza l'AEEI che viene aggiunto alla sospensione contenente il virus ad una concentrazione dello 0,025÷0,05%. Una volta completata l'inattivazione, l'AEEI viene neutralizzato aggiungendo tiosolfato di sodio alla sospensione.

L'antigene risultante viene purificato dalle impurità di zavorra mediante PHMG, che viene aggiunto alla sospensione ad una concentrazione di 0,005÷0,007%.

Il materiale antigenico avirulento e purificato proveniente dal ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007-DEP è una sospensione contenente prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S dell'afta epizootica.

Il contenuto quantitativo e qualitativo del materiale virale è determinato mediante turbidimetria.

Per preparare il vaccino, viene utilizzato materiale virale contenente almeno 0,5 μg di 146S e 75S dei componenti immunogenici dell'afta epizootica in 1 cm 3 .

La concentrazione richiesta dei componenti immunogenici 146S e 75S dell'afta epizootica nel vaccino proposto, che è di almeno 3 μg per 1 cm 3 prodotto finito, si ottengono aggiungendo una quantità calcolata di GOA adiuvante-assorbente al materiale antigenico avirulento e purificato. Il contenuto ottimale di GOA in 1 cm 3 del prodotto finito è compreso tra 11.000,0 µg e 15.000,0 µg.

Al concentrato risultante viene aggiunto un ulteriore 10%. soluzione acquosa saponina alla velocità di 1500,0 mcg per dose di vaccinazione. Ad esempio, per la dose di inoculo ottimale di 2 cm 3 la concentrazione finale è dello 0,075%, che corrisponde a 750,0 μg del suo contenuto in 1 cm 3 di prodotto finito.

Il vaccino risultante è un liquido giallo chiaro con un sedimento sciolto dell'assorbente, che si forma sul fondo della bottiglia durante la conservazione e si rompe facilmente in una sospensione omogenea quando agitato.

La presente invenzione comprende il seguente insieme di caratteristiche essenziali che forniscono un risultato tecnico in tutti i casi per i quali viene richiesta protezione legale.

2. Il principio attivo sotto forma di materiale antigenico avirulento e purificato dal ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP in una quantità efficace.

3. Obiettivo degli additivi.

Caratteristiche dell'invenzione che caratterizzano il vaccino proposto e coincidono con le caratteristiche del prototipo, incluso concetto generico, riflettendo lo scopo, sono:

1. Vaccino contro l'afta epizootica di tipo A inattivato assorbito.

2. Sostanza attiva.

3. Obiettivo degli additivi.

Rispetto al vaccino prototipo, la caratteristica distintiva essenziale del vaccino proposto è che, come sostanza attiva contiene materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo A in una quantità efficace.

La presente invenzione è caratterizzata anche da altro tratti distintivi esprimere forme specifiche esecuzione o condizioni speciali il suo utilizzo.

1. Materiale antigenico avirulento e purificato proveniente dal ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007, ottenuto in un sistema biologico sensibile e che rappresenta una sospensione contenente prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S dell'afta epizootica di tipo A.

2. Materiale antigenico avirulento e purificato proveniente dal ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007, ottenuto preferibilmente da una coltura cellulare trapiantabile di origine animale e che rappresenta una sospensione contenente prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S dell'afta epizootica di tipo A.

3. Materiale antigenico avirulento e purificato proveniente dal ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007, ottenuto preferibilmente in una coltura cellulare continua di VNK-21 e che rappresenta una sospensione contenente prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S dell'afta epizootica di tipo A.

4. Materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007-DEP, ottenuto preferibilmente in una coltura cellulare continua VNK-21 e che rappresenta una sospensione contenente prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S dell'afta epizootica di tipo A in una quantità pari a almeno 3,0 mcg in 1 cm 3 di prodotto finito.

5. Come additivo mirato, il vaccino contiene un adiuvante-assorbente di GOA.

6. GOA preferibilmente nella quantità di 11000,0÷15000,0 μg per 1 cm 3 di prodotto finito.

7. Come additivo mirato, il vaccino contiene l'adiuvante saponina.

8. Saponina preferibilmente nella quantità di 500,0 ÷ 1500,0 μg per 1 cm 3 di prodotto finito.

9. Come integratore mirato, il vaccino contiene un mezzo di supporto.

10. Mezzo di manutenzione in una quantità fino a 1.000.000,0 μg per 1 cm 3 del prodotto finito.

11. Materiale antigenico avirulento e purificato dal ceppo A rapporto n., mcg:

Il vaccino proposto ha un'elevata attività immunogenica e fornisce protezione affidabile contro l'afta epizootica sierotipo A, circolante nei paesi del Caucaso, dell'Asia centrale, del Medio ed Estremo Oriente.

Il risultato tecnico derivante dall'uso dell'invenzione si ottiene grazie al fatto che il materiale antigenico del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 del sierotipo A dell'afta epizootica, che ha un'elevata attività biologica, antigenica e immunogenica in forma nativa e dopo inattivazione e che prevede la produzione di un vaccino adsorbito inattivato contro l'afta epizootica che crea una protezione efficace per gli animali sensibili contro l'afta epizootica sierotipo A, che provoca epidemie in l'anno scorso nei paesi della Transcaucasia, dell'Asia centrale, del Vicino ed Estremo Oriente.

Il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 è nuovo, precedentemente sconosciuto. Il virus iniziale per ottenere il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 è stato isolato da campioni di materiale aftico di una giovenca malata ricevuti dalla FGU "ARRIAH" nel dicembre 2007 dalla Repubblica del Kirghizistan (perizia n. 2045 "Kyrgyzstan/07") . Il ceppo produttivo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo A è stato ottenuto mediante passaggi successivi su colture cellulari sensibili etero- e omologhe.

Il ceppo risultante è stato depositato il 7 luglio 2009 nella Collezione statale panrussa di ceppi di microrganismi utilizzati in medicina veterinaria e zootecnia, Federale Istituzione pubblica"Tutto russo centro statale qualità e standardizzazione medicinali per animali e mangimi" (FGU "VGNKI") con il numero di registrazione (link): ceppo produttivo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP dell'afta epizootica di tipo A.

Il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007-DEP dell'afta epizootica di tipo A è caratterizzato da i seguenti segnali e proprietà.

Proprietà morfologiche

Il ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP appartiene alla famiglia Picornaviridae, genere Aphtovirus, sierotipo A e presenta caratteristiche morfologiche caratteristiche del patogeno dell'afta epizootica: forma del virione icosaedrico, dimensioni 23-25 ​​​​nm. Un virione è costituito da una molecola di RNA racchiusa in un guscio proteico. Guscio proteicoè costituito da 32 capsomeri disposti a simmetria cubica.

Proprietà antigeniche

Il ceppo virale A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica appartiene, per le sue proprietà antigeniche, al sierotipo A. Il virus viene neutralizzato stabilmente dall'antisiero omologo. Il virus non mostra attività emoagglutinante (attività HA). Negli animali malati, nel siero del sangue si formano anticorpi che vengono rilevati dosaggio immunoenzimatico(ELISA) e reazioni di microneutralizzazione (RMN). Quando i bovini vengono immunizzati con un vaccino proveniente da un virus inattivato, questo ne induce la formazione anticorpi specifici rilevato in ELISA, RDP e RMN.

Con iperimmunizzazione porcellini d'India l'antigene concentrato del virus inattivato dell'afta epizootica di tipo A ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 induce la formazione di anticorpi virus-specifici e virus neutralizzanti rilevati in RSK alle diluizioni di 1:80÷1:160 e in ELISA alle diluizioni 1:10000÷1:12000.

La relazione antigenica del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo A con il ceppo produttore dell'afta epizootica A 22 n. 550 e con i ceppi precedentemente isolati nel continente asiatico è stata studiata in RSK, ELISA e RMN.

I risultati degli studi nell'RSC sono presentati nella Tabella 1. La parentela antigenica (R) del ceppo A n. 2045 / Kirghizistan / 2007 con altri virus dell'afta epizootica del sierotipo A è stata dell'8% per A / Iran / 97, A 22 / Iraq 24 /64 - 28%, A/Iran/05 - 68%, A/Turchia/06 - 66%, A 22 N. 550 - 14%.

I risultati degli studi nell'RMN sono presentati nella tabella 2. La corrispondenza antigenica (r 1) era per A / Iran / 97 - 0,125, A 22 N. 550 - 0,17, A 22 / Iraq 24/64 - 0,6, A / Turchia /06 - 0,5. Con un valore r 1 >0,3, l'isolato di campo e il ceppo di produzione sono strettamente correlati e un vaccino proveniente dal ceppo di produzione proteggerà dal virus epizootico, con un valore r pari a 1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса .

I risultati degli studi ELISA sono presentati nella tabella 3. La corrispondenza antigenica (r 1) era per A 22 No. 550 - 0,24, A 22 / Iraq 24/64 - 0,24, A / Iran / 97 - 0,19, A / Turchia /06 - 0,5. Quando il valore di r 1 è pari a 0,4÷1,0, l'isolato di campo ed il ceppo di produzione sono in stretta relazione antigenica; con un valore di r 1 0,2÷0,39, l'isolato di campo è antigenicamente correlato al ceppo di produzione, il vaccino del ceppo di produzione può essere utilizzato se non viene trovato più ceppo correlato e a condizione che gli animali siano immunizzati più di 1 volta; con valore r 1<0,2 полевой изолят отличается от производственного штамма, вакцина из которого не приемлема для защиты от заражения полевым вирусом .

Caratterizzazione genetica molecolare

La struttura primaria del gene VP 1 dell'FMDV tipo A, ceppo A N. 2045/Kirghizistan/2007 è stata determinata mediante sequenziamento nucleotidico ed è stata derivata la struttura primaria della proteina VP 1. L'analisi comparativa delle sequenze nucleotidiche ha mostrato che il ceppo A N. 2045/Kyrgyzstan/2007 stretta relazione filogenetica con i ceppi A/Iran/05 e A/Turkey/06 (percentuale di differenze nucleotidiche 3,82÷4,3 e 4,46÷5,57, rispettivamente) e differisce significativamente dal ceppo vaccinale A 22 n. 550. Inoltre , differisce dai ceppi di questo tipo di virus isolati nel 1998 in Armenia e Turchia, nonché in Georgia e Iran nel 1999 (vedi dendrogramma). Il grado delle differenze nucleotidiche nelle sequenze del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 del virus dell'afta epizootica di tipo A rispetto ai ceppi del virus dell'afta epizootica di tipo sierologico A è stato: con il ceppo A 22 n. 550 - 18,15%, con ceppo A n. 1707 "Armenia-98" - 17, 68%, con ceppo A/Turchia/98 - 17,2%, con ceppo A (Georgia) 1999/ n. 1721 - 18,79%, con ceppo A/Iran/99 - 17,68%.

Pertanto, l’analisi filogenetica ha dimostrato che il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell’afta epizootica di tipo A appartiene a una nuova linea genetica del sierotipo A dell’afta epizootica.

Caratteristiche biotecnologiche

Il ceppo A No. 2045/Kyrgyzstan/2007 è riprodotto in una coltura monostrato di cellule di rene suino (SP), colture cellulari continue PSGK-30, VNK-21 e IB-RS-2, ed entro 20÷24 ore di incubazione, il la resa virale in queste colture cellulari raggiunge valori compresi tra 6,33 e 8,25 lg TCD 50 -/cm 3 (tabella 4). Con infezione massiva (1÷10 TCD/cellula) provoca CPP dopo 5 ore. Mantiene le sue caratteristiche originali se passato in colture cellulari per 10 passaggi (periodo di osservazione).

Caratteristiche chemio- e genotassonomiche

Il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo A è un virus contenente RNA con un peso molecolare di 7×10 6 D.

L'acido nucleico è rappresentato da una molecola lineare a filamento singolo con un peso molecolare di 2,8×10 6 D. Il virione ha un rivestimento proteico costituito da quattro proteine ​​principali VP 1 , VP 2 , VP 3 e VP 4 . La membrana lipoproteica è assente.

La principale proteina antigenica è VP 1 . Il virione contiene circa il 31,5% di RNA e il 68,5% di proteine. L'RNA virione è infettivo ed è coinvolto nella formazione di proteine ​​​​precursori nelle cellule infette. I precursori, a loro volta, vengono scissi per formare polipeptidi virali strutturali e non strutturali più stabili. Degli 8 polipeptidi non strutturali che si accumulano nelle cellule infette, uno (BP 56a) è una RNA polimerasi RNA-dipendente coinvolta nella replicazione dell'RNA di nuovi virioni.

Proprietà fisiche

Il peso del virione è 8,4×10 -18 g Il coefficiente di sedimentazione di 146S nel gradiente di saccarosio. Densità di galleggiamento 1,45 g/cm 3 .

Resistenza a fattori esterni

Il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 è resistente all'etere, al cloroformio, al freon, all'acetone e ad altri solventi organici e detergenti. Più stabile a pH 7,2÷7,6. Le variazioni del pH, sia acido che alcalino, portano all’inattivazione del virus.

Sensibile alla formaldeide, ai raggi UV, alle radiazioni, alle alte temperature.

Funzionalità e proprietà aggiuntive

Attività immunogenica - immunogenica come parte di un vaccino inattivato.

Reattogenicità - non possiede proprietà reattogeniche.

Patogenicità - patogeno per animali artiodattili, topi neonati, porcellini d'India.

Virulenza - Virulento per gli animali naturalmente sensibili per contatto, aerosol e infezione parenterale.

Stabilità: conserva le proprietà biologiche originali quando viene passato in sistemi biologici sensibili per 10 passaggi.

Il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo A presenta un'elevata attività biologica, antigenica e immunogenica sia in forma nativa che dopo inattivazione.

Sulla base dei dati ottenuti si può sostenere che il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007, secondo gli spettri antigenici e immunologici, è una variante originale, tassonomicamente nuova, precedentemente sconosciuta dell’afta epizootica di tipo A.

Per ridurre il pericolo epizootico, è necessaria la vaccinazione tempestiva dei nuovi focolai emergenti della malattia, che richiede vaccini topici altamente immunogenici.

L'analisi dello stato della tecnica effettuata dal Richiedente, inclusa la ricerca attraverso fonti di informazione brevettuali e scientifiche e tecniche, e l'identificazione di fonti contenenti informazioni su analoghi dell'invenzione proposta, ha permesso di stabilire che il Richiedente non ha trovato fonti caratterizzate da caratteristiche che sono identiche (identiche) a tutte le caratteristiche dell'invenzione proposta. La definizione dall'elenco degli analoghi identificati del prototipo, come l'analogo più vicino in termini di totalità delle caratteristiche, ha permesso di stabilire la totalità delle caratteristiche distintive del vaccino proposto, che sono significative in relazione al risultato tecnico percepito dalla ricorrente, come esposto in autonoma domanda.

Pertanto, il vaccino rivendicato corrisponde al livello di brevettabilità “novità”.

Per verificare la conformità del vaccino proposto alla condizione di brevettabilità “fase inventiva”, è stata effettuata un'ulteriore ricerca di soluzioni note per individuare le caratteristiche incluse nella parte distintiva della rivendicazione indipendente. I risultati della ricerca hanno mostrato che la soluzione proposta non segue esplicitamente per uno specialista la tecnica nota esposta nella sezione corrispondente della descrizione (non sono state identificate soluzioni che abbiano caratteristiche che coincidono con le caratteristiche distintive dell'invenzione proposta), e non è stato identificato l'effetto delle trasformazioni previste dalle caratteristiche essenziali del vaccino proposto per ottenere un risultato tecnico.

Pertanto, il vaccino proposto soddisfa la condizione di brevettabilità “passo inventivo”.

L'essenza dell'invenzione è spiegata negli elenchi di sequenza, in cui:

SEQ ID NO:1 rappresenta la sequenza nucleotidica del gene della proteina VP 1 del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo A.

SEQ ID NO:2 sequenza amminoacidica della proteina VP 1 del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo A.

L'essenza dell'invenzione è illustrata su un dendrogramma che riflette le relazioni filogenetiche del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 dell'afta epizootica di tipo sierologico A con i ceppi epizootici e vaccinali dell'afta epizootica di tipo A. Il dendrogramma si basa sul confronto del nucleotide completo sequenze del gene VP1.

L'essenza dell'invenzione è illustrata da esempi del suo utilizzo, che non limitano la portata dell'invenzione.

Il ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 L'afta epizootica di tipo A è stato isolato dal materiale di campo ricevuto dall'Istituto statale federale "ARRIAH" sotto forma di epitelio di afte da bovini sospettati di avere l'afta epizootica durante la diagnosi di laboratorio di questa malattia e la sua differenziazione da altre malattie vescicolari. Durante l'isolamento del virus è stato utilizzato un complesso di metodi biologici, virologici e biochimici.

I metodi biologici e virologici includevano l'inoculazione del materiale dell'isolato bovino di campo e il successivo adattamento del virus a colture di linee cellulari primarie trypsinizzate e trapiantate. Sono state utilizzate colture cellulari SP, PSGK-30, IB-RS-2 e VNK-21. Colture cellulari primarie e continue per l'impostazione di un saggio biologico sono state coltivate su terreni nutritivi appropriati in condizioni stazionarie in fiale con una capacità di 50÷100 cm 3 , lavate dal terreno di crescita e infettate con una sospensione al 10% di materiale aftoso (molteplicità dell'infezione era 1÷10 nella soluzione di Hank con HLA allo 0,5% e antibiotici standard. Per rimuovere la microflora e i componenti delle cellule di zavorra, la sospensione è stata trattata con cloroformio in un rapporto di 1:10. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37°C, nelle beute sono stati aggiunti 5÷10 cm 3 del mezzo di supporto e incubati a 37°C fino alla comparsa del CPE del virus. In presenza di CPD (arrotondamento delle cellule, aumento della loro densità ottica, degenerazione e separazione delle cellule dal vetro), le fiale sono state sottoposte a congelamento-scongelamento, purificazione della sospensione cellulare con cloroformio e centrifugazione a 3000 g per 15 minuti. Il materiale risultante contenente il virus è stato utilizzato per successivi passaggi e ricerche in RSK ed ELISA per la presenza dell'antigene virale, utilizzando un set di sieri commerciali tipo-specifici e sieri conservati nel Museo dei ceppi dell'Istituto statale federale "ARRIAH".

I risultati dell'adattamento del virus a varie colture cellulari sono presentati nella Tabella 4.

I dati riportati nella tabella 4 indicano una buona attività adattativa del ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 FMDV tipo A alle colture cellulari utilizzate.

Il virus isolato con i metodi sopra indicati è stato esaminato nell'RSK con una serie di kit diagnostici per tutti i tipi di virus dell'afta epizootica al fine di identificare l'affiliazione al tipo.

I risultati della tipizzazione del virus nelle RSC sono presentati nella Tabella 5.

I risultati riportati nella Tabella 5 indicano che il virus isolato appartiene al tipo A.

Il vaccino contro l'afta epizootica di tipo A, adsorbito inattivato, è preparato dal ceppo virale A n. 2045/Kirghizistan/2007, coltivato in una coltura in sospensione di cellule VNK-21. Come mezzo di supporto viene utilizzata la soluzione di Earl senza siero con l'aggiunta di FGMS, GBCS e antibiotici a pH 7,4÷7,8. La coltura cellulare viene infettata dal virus in ragione di 0,001÷0,05 TCD 50 per cellula.

La coltivazione del virus viene effettuata ad una temperatura di 36÷37°C. Dopo 11÷13 ore di incubazione, le cellule vive e morte vengono contate mediante colorazione con trypan blu. Se il numero di cellule vive è del 15÷20%, allora l'incubazione viene protratta per altre 2÷3 ore. Quando il numero di cellule morte raggiunge il 90÷95%, la coltivazione viene interrotta e la sospensione contenente il virus viene controllata per la sterilità e il contenuto dei componenti 146S e 75S. La quantità di componenti 146S+75S nella sospensione deve essere almeno 0,5 µg/cm 3 .

Le tabelle 6, 7, 8 e 9 mostrano i risultati della coltivazione dei ceppi A No. 2045/Kyrgyzstan/2007, A (Georgia) 1999/ No. 1721-DEP, A No. 1707 "Armenia-98-DEP" e A 22 No 550 dell'afta epizootica di tipo A, da cui consegue che le proprietà culturali dei ceppi elencati differiscono significativamente in due parametri studiati:

1) il ceppo A n° 2045/Kirghizistan/2007 ha un periodo di riproduzione più breve (12,5 ore) rispetto al ceppo A (Georgia) 1999/n° 1721-DEP e A n° ore);

2) i ceppi A n. 2045/Kirghizistan/2007 e A 22 n. 550 danno una resa maggiore di componenti immunogenici (90,1% e 89,9%, rispettivamente) rispetto ai ceppi A (Georgia) 1999/ n. 1721-DEP e A n. 1707 "Armenia-98-DEP" (rispettivamente 61,5% e 58,1%).

Subito dopo la fine del ciclo di riproduzione del virus, senza interrompere la termostatazione, alla sospensione contenente il virus viene aggiunta una soluzione di AEEI al 15÷20%, acidificata con acido acetico glaciale a pH 8,0÷8,5. La concentrazione finale di AEEI nella sospensione contenente il virus dovrebbe essere 0,025÷0,05%. L'inattivazione dell'infettività del virus viene effettuata per 12÷24 ore a 36÷37°C e pH 7,2÷7,6 con agitazione dopo 5÷6 ore per 3÷5 minuti. Il residuo AEEI viene neutralizzato mediante aggiunta di tiosolfato di sodio.

Alla sospensione calda viene aggiunta una soluzione di PHMG al 10% ad una concentrazione di 0,005÷0,007% per flocculare le impurità della zavorra ed inattivare eventuali contaminanti. Le impurità della zavorra flocculata sono sottoposte a sedimentazione seguita da decantazione.

La tabella 10 mostra i risultati degli studi sull'effetto dell'inattivazione e della purificazione del materiale antigenico utilizzando AEEI e PHMG sui componenti immunogenici (146S e 75S) dei ceppi di FMDV A No. 2045/Kyrgyzstan/2007 e A (Georgia) 1999/ No. 1721-DEP.

I dati presentati nella Tabella 10 indicano che i componenti immunogenici del ceppo virale dell'afta epizootica A n. 2045/Kirghizistan/2007 non sono inferiori in termini di resistenza all'inattivazione e alla purificazione in condizioni di produzione rispetto al virus dell'afta epizootica ceppo A (Georgia) 1999/ N. 1721-DEP. Di particolare importanza è il fatto che durante l'inattivazione e la purificazione del virus dal ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 non si sono verificati cambiamenti significativi nella quantità dei componenti 146S e 75S ottenuti durante la riproduzione del virus.

L'antigene risultante è controllato per quanto riguarda l'avirulenza, il contenuto di proteine ​​specifiche del virus, i componenti 146S e 75S del virus e la sterilità. La concentrazione richiesta dei componenti 146S e 75S nella dose di inoculazione del vaccino adsorbito si ottiene concentrando l'antigene GOA.

Il volume stimato della concentrazione di GOA al 3% viene aggiunto alla sospensione di antigene raffreddata con l'agitatore in funzione. L'agitazione viene effettuata per 30 minuti. Dopo la sedimentazione del GOA, il volume calcolato della sospensione rimanente viene drenato. La concentrazione finale di GOA deve essere compresa tra 1,62 ± 0,488 R<0,01 мг/см 3 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 3,0 мкг/см 3 готового препарата. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,05÷0,15%, что соответствует 500,0÷1500,0 мкг сапонина в 1 см 3 готовой вакцины.

Il vaccino risultante è confezionato in fiale di vetro e la sua sterilità è controllata secondo GOST 28085.

L'avirulenza e l'innocuità del vaccino vengono testate su 5 capi di bestiame somministrando il vaccino prima sotto la mucosa della lingua alla dose di 2,0 cm 3 e poi per via sottocutanea alla dose di 10,0 cm 3 . Le condizioni cliniche degli animali vengono monitorate per 10 giorni. Un vaccino avirulento, innocuo e sterile viene testato per l'attività immunogenica nei bovini o nei porcellini d'India.

Il vaccino risultante è un liquido giallo chiaro con un precipitato bianco sciolto dell'assorbente, che si forma sul fondo della fiala durante la conservazione e si rompe facilmente in una sospensione omogenea quando agitato.

La composizione ottimale dei componenti del vaccino adsorbato ottenuto contro l'afta epizootica di tipo A è mostrata nella Tabella 11.

L'avirulenza e l'innocuità del vaccino sono state testate su 5 capi di bestiame. Il farmaco è stato somministrato a ciascun animale sotto la mucosa della lingua alla dose di 2,0 cm 3 e poi per via sottocutanea alla dose di 10,0 cm 3 . La condizione clinica degli animali è stata monitorata per 10 giorni.

Al termine del controllo dell'avirulenza e dell'innocuità, il vaccino è stato testato per l'attività immunogenica. Il test è stato effettuato su 4 capi di vitelli del peso di 70÷80 kg. Il vaccino adsorbato è stato iniettato per via sottocutanea alla dose di 2,0 cm 3 . L'infezione di controllo dei vitelli è stata effettuata con un ceppo omologo del virus dell'afta epizootica il 28° giorno dopo la vaccinazione (WPV). I risultati della ricerca sono presentati nella tabella 12.

Dai dati presentati nella tabella 12 è emerso che 1 vitello su 4 si è ammalato, 3 sono risultati protetti dalla generalizzazione del processo il 28° giorno dopo la vaccinazione. Il livello di immunità umorale negli animali vaccinati era di 4,81±0,53 log2.

È stato testato il vaccino adsorbato contro l'afta epizootica di tipo A, prodotto come descritto nell'esempio 2 e contenente μg:

L'avirulenza e l'innocuità del vaccino risultante sono state testate su 5 capi di bestiame. Il farmaco è stato somministrato a ciascun animale sotto la mucosa della lingua alla dose di 2,0 cm 3 e poi per via sottocutanea alla dose di 10,0 cm 3 . La condizione clinica degli animali è stata monitorata per 10 giorni dopo l'infezione.

Al termine del controllo dell'avirulenza e dell'innocuità, il vaccino è stato testato per l'attività immunogenica. Il test è stato effettuato su 5 capi di bovini del peso di 250÷300 kg e su 5 capi di vitelli del peso di 70÷80 kg. Il vaccino adsorbato è stato iniettato per via sottocutanea alla dose di 2,0 cm 3 . L'infezione di controllo è stata effettuata con un ceppo omologo di FMDV a 28 giorni post-vaccinazione (DPV) per i vitelli e a 90 giorni per i tori. I risultati della ricerca sono presentati nelle tabelle 13÷14.

Dai dati presentati nelle tabelle 13÷14 è ​​emerso che 1 toro su 5 si è ammalato, 4 sono risultati protetti dalla generalizzazione del processo al 90° giorno dopo la vaccinazione e tutti e 5 i vitelli sono risultati protetti dalla generalizzazione del processo al 90° giorno successivo alla vaccinazione. il 28° giorno dopo la vaccinazione. Il livello di immunità umorale negli animali vaccinati al momento dell'infezione era di 5,00±0,27 log2 per i tori e di 6,20±0,63 log2 per i vitelli, il che indica l'efficacia del vaccino testato.

Pertanto, le informazioni di cui sopra indicano che quando si utilizza il vaccino proposto è soddisfatta la seguente serie di condizioni:

il vaccino adsorbito inattivato contro l'afta epizootica di tipo A, incorporante la presente invenzione, è destinato all'uso in agricoltura, vale a dire in virologia veterinaria e biotecnologia;

Per l'invenzione proposta nella forma descritta nella rivendicazione indipendente, è confermata la possibilità della sua realizzazione utilizzando i mezzi e metodi indicati nella domanda o noti prima della data di priorità;

Il vaccino contro l'afta epizootica di tipo A inattivato adsorbito, prodotto dal ceppo A n. 2045/Kirghizistan/2007 secondo l'invenzione, ha un'elevata attività immunogenica ed è in grado di fornire una protezione efficace degli animali sensibili contro l'afta epizootica di tipo A, circolante nei paesi di il Caucaso, l'Asia centrale, il Vicino ed Estremo Oriente.

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17. Selezione dei ceppi vaccinali contro l'afta epizootica - una revisione/ D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bregman // Rev. sci. Tecn. O.I.E. -2005. - Vol.24, N. 3. - P. 981÷993.

RECLAMO

1. Vaccino antiafta epizootica di tipo A adsorbito inattivato, contenente la sostanza attiva e additivi mirati, caratterizzato dal fatto che come sostanza attiva contiene materiale antigenico avirulento e purificato proveniente dal ceppo virale Aphtae epizooticae, fam. Picornaviridae, genere Aphtovirus, sierotipo A, depositato nella collezione dell'Istituto federale statale "VGNKI" con il numero di registrazione del ceppo produttivo del virus dell'afta epizootica sierotipo A n. 2045/Kirghizistan/2007-DEP, in una quantità effettiva.

2. Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che contiene materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP, ottenuto in un sistema biologico sensibile e che rappresenta una sospensione contenente prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S di FMDV tipo A.

3. Vaccino secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che contiene materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP, ottenuto preferibilmente in una coltura cellulare trapiantata di origine animale e che rappresenta una sospensione contenente principalmente 146S e Componenti immunogenici 75S dell'afta epizootica di tipo A.

4. Vaccino secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che contiene materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP, ottenuto preferibilmente in una coltura cellulare continua VNK-21 e che rappresenta una sospensione contenente principalmente 146S e Componenti immunogenici 75S dell'afta epizootica di tipo A.

5. Vaccino secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che contiene materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n. 2045/Kyrgyzstan/2007-DEP, ottenuto preferibilmente in una coltura cellulare continua VNK-21 e che rappresenta una sospensione contenente principalmente 146S e Componenti immunogenici 75S del virus dell'afta epizootica di tipo A in una quantità di almeno 3,0 μg per 1 cm 3 del prodotto finito.

6. Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di contenere come additivo bersaglio un idrossido di alluminio adiuvante-sorbente (GOA).

7. Vaccino secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto di contenere GOA, preferibilmente nella quantità di 11000,0÷15000,0 μg per 1 cm 3 di prodotto finito.

8. Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di contenere un adiuvante saponinico come additivo bersaglio.

9. Vaccino secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto di contenere il coadiuvante saponina, preferibilmente nella quantità di 500,0÷1500,0 μg per 1 cm 3 di prodotto finito.

10. Vaccino secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di contenere un mezzo di supporto come additivo bersaglio.

11. Vaccino secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto di contenere un mezzo di supporto in quantità fino a 1.000.000,0 μg per 1 cm 3 di prodotto finito.

12. Vaccino secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, caratterizzato dal fatto che contiene materiale antigenico avirulento e purificato del ceppo A n., prevalentemente componenti immunogenici 146S e 75S del virus dell'afta epizootica di tipo A, GOA, saponina e mezzo di supporto nel rapporto, mcg.

Nome (rus.) VACCINO CONTRO L'FMD UNIVERSALE MONO E POLIVALENTE SORBATO DAL VIRUS COLTIVATO IN CELLULE VNK-21 Composizione e forma di dosaggio È un liquido grigio chiaro con un precipitato sciolto che si forma durante la conservazione e si rompe facilmente in una sospensione uniforme quando il la fiala è agitata. Prodotto in bottiglie da 50, 100 e 200 ml. Proprietà farmacologiche Il componente attivo del vaccino è un virus dell'afta epizootica purificato e inattivato di uno o più sierotipi. Il vaccino, se somministrato per via parenterale agli animali, provoca la formazione di un'intensa immunità all'afta epizootica. L'immunità negli animali appena vaccinati si forma entro 21 giorni. L'immunità intensa negli animali vaccinati dura 12 mesi. Indicazioni Per l'immunizzazione d'emergenza e profilattica di bovini, bufali, yak, pecore, capre e suini contro l'afta epizootica causata dai virus di tipo A, O, C, Asia 1, Sat 1, Sat 2 e Sat 3. Dosi e modalità di somministrazione Quando si verifica l'afta epizootica o è una minaccia imminente, per creare l'immunità nelle fasi iniziali dopo la vaccinazione, gli animali sensibili vengono vaccinati una volta con una dose doppia di vaccino in due punti. Gli animali giovani nati da madri precedentemente vaccinate vengono vaccinati a partire dai 2 mesi di età e, nelle zone in cui non è stata precedentemente effettuata la vaccinazione contro l'afta epizootica, a partire da un giorno di età. A scopo profilattico, nelle aree di applicazione sistematica del vaccino, tutti gli animali vengono vaccinati una volta, una volta all'anno: bovini a partire dai 4 mesi di età; suini, ovini e caprini a partire dai 2 mesi di età. Negli allevamenti in cui non è stato precedentemente utilizzato il vaccino contro l'afta epizootica, durante il primo anno tutti gli animali vengono vaccinati una volta, indipendentemente dall'età, in futuro secondo lo schema sopra indicato. Il vaccino viene somministrato agli animali alle dosi indicate sull'etichetta del flacone nel rispetto delle regole di asepsi e antisepsi: bovini, bufali e yak - per via sottocutanea nel terzo medio del collo o giogaia; pecore e capre - per via sottocutanea dall'interno della coscia; maiali - per via intramuscolare - dietro le orecchie. Siringhe e aghi vengono sterilizzati mediante ebollizione, il sito di iniezione viene disinfettato con alcol etilico al 70%. Per ciascun animale viene utilizzato un ago separato. Effetti collaterali In alcuni animali dopo l'immunizzazione per 1-3 giorni si può registrare un leggero aumento della temperatura corporea e una diminuzione dell'appetito, che non richiedono un trattamento speciale. Gli animali che sviluppano una reazione allergica dopo l'immunizzazione vengono trattati con antistaminici. Controindicazioni Animali clinicamente malati. Istruzioni speciali Carne, latte e altri prodotti ottenuti da animali sani vengono utilizzati senza restrizioni. Un vaccino con l'integrità della fiala rotta, un'etichetta mancante, la presenza di impurità, nonché uno inutilizzato il giorno dell'apertura della fiala viene rifiutato. Il vaccino rifiutato non richiede misure speciali per la distruzione, è sicuro per gli animali, l’uomo e l’ambiente. Condizioni di conservazione In un luogo asciutto e buio a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C. Data di scadenza: 18 mesi. Produttore Centro federale per la salute animale FGU (ARRIAH FGU), Russia

Vaccino concentrato di saponina GOA con una singola iniezione alla dose di 1 ml, ha fornito una protezione quasi del 100% del bestiame durante l'infezione sperimentale con il metodo generalmente accettato. L'immunità espressa si manifesta il 10-14esimo giorno e raggiunge il massimo 3-4 settimane dopo la vaccinazione. L'immunità negli animali adulti dura 6-12 mesi. La rivaccinazione migliora notevolmente l'immunità. Con la vaccinazione preventiva diffusa, i bovini vengono solitamente rivaccinati una volta all'anno, i maiali due volte. I VNA nel siero del sangue compaiono entro la fine della prima settimana, raggiungono il titolo massimo in 3-5 settimane, quindi la loro concentrazione diminuisce gradualmente. I VNA compaiono più velocemente e raggiungono il picco dopo l'introduzione dei vaccini adsorbiti, tuttavia, dopo l'uso dei vaccini emulsionati, il titolo anticorpale è più elevato e persistono più a lungo. L'immunità colostrale è ben espressa, gli anticorpi nei vitelli persistono per 5 mesi, sebbene la protezione passiva duri fino a 3 mesi.

L’immunità materna può sopprimere l’effetto vaccinazione negli animali giovani, quindi, la vaccinazione dei vitelli con vaccinazione sistematica delle mucche inizia a partire dai 3-4 mesi di età. Tuttavia, esistono prove che i vitelli rispondono alla vaccinazione a un mese di età o prima.

La comparsa e il decorso dell'afta epizootica in una zona svantaggiata sono in gran parte determinati dall’immunità di gruppo. Se il livello di immunità in una popolazione di specie naturalmente sensibili supera il 75%, la malattia sarà sotto controllo, sebbene siano efficaci misure come il controllo delle importazioni di bestiame, la quarantena e la macellazione locale nell’area colpita.

Vaccini inattivati può essere mono o polivalente, cioè contenere antigeni di uno o più tipi, sottotipi e varianti del virus. Nella produzione di vaccini polivalenti, il rapporto quantitativo degli antigeni virali deve essere determinato tenendo conto della loro immunogenicità.

Vaccinazione simultanea di un grande bovini contro l’afta epizootica e la peste si rivelò possibile. Se il vaccino GOA polivalente inattivato contro l'afta epizootica e il vaccino vivo contro la peste vengono iniettati simultaneamente per via sottocutanea nel collo da lati diversi, si forma la stessa immunità della vaccinazione separata contro ciascuna malattia. La ricerca e lo sviluppo nel campo della prevenzione specifica dell'afta epizootica hanno raggiunto un livello elevato.

Inattivato Vaccini contro l'afta epizootica sono preparati altamente efficaci e la tecnologia della loro produzione si basa sulle più moderne conquiste della scienza biologica. Il successo e la produzione di vaccini inattivati ​​contro l'afta epizootica possono essere utilizzati come soluzioni prototipo nella ricerca e nello sviluppo di vaccini inattivati ​​contro altre malattie umane e animali.

Non è chiaro se sia moderno vaccini inattivati proteggere gli animali dall'infezione latente nelle aree endemiche per l'afta epizootica. In caso contrario, quali dovrebbero essere per raggiungere questo obiettivo.

Grande interesse fornire informazioni che nei suini vaccinati dopo l'infezione sperimentale in assenza di segni clinici della malattia, il virus è stato trovato in una concentrazione sufficientemente elevata nella cavità orale per diverse settimane. La sua presenza nella cavità orale dipende direttamente dal livello di immunità. L'attecchimento del virus nel corpo degli animali vaccinati è stato indicato anche da un forte aumento del titolo VNA. Di grande interesse scientifico e pratico è la delucidazione del luogo di riproduzione del virus in tali animali.

Vaccini vivi contro l'afta epizootica non sviluppato. Numerosi tentativi in ​​questo settore non hanno dato risultati positivi. I ceppi attenuati, di regola, si sono rivelati debolmente immunogenici o reversibili. Sotto questo aspetto, l’FMDV differiva significativamente dal poliovirus, i cui ceppi attenuati sono stati utilizzati con successo per l’immunizzazione orale negli esseri umani. La ragione di queste differenze è sconosciuta. È possibile che risieda nella diversa patogenesi di queste malattie. La poliomielite, come molte malattie virali, ha una patogenesi complessa. I loro agenti patogeni sono caratterizzati da un sito primario di replicazione con successiva penetrazione in uno o più organi bersaglio. Nel poliovirus, il sito primario di riproduzione è l'intestino, mentre il sito secondario è il sistema nervoso centrale. Tali virus sembrano essere relativamente facili da attenuare alterando selettivamente il tropismo per gli organi bersaglio secondari. A differenza di loro, il virus dell'afta epizootica, così come gli agenti causali di una serie di altre infezioni topiche, praticamente non hanno un organo bersaglio secondario. Ottenere ceppi immunogenici attenuati contro tali malattie probabilmente richiede approcci diversi ed è un compito più difficile.

Rinovirus cavalli 1 è più vicino agli aphthovirus in molte proprietà che ad altri picornavirus. Alcuni ceppi di questo virus possono causare viremia, una malattia sistemica nei cavalli affetti da sindrome respiratoria. Il virus può essere eliminato con le feci. Non sono stati sviluppati mezzi di prevenzione specifica.