Argomento 10. Uso delle colture cellulari in virologia. Tipi di colture cellulari

Domande di controllo

Compito per la prossima lezione.

Riassumendo la lezione.

Compiti

1. Preparare gli embrioni di pollo per l'infezione.

2. Infettare gli embrioni di pollo con i virus della malattia di Newkael e della varicella (pollo).

3. Aprire gli embrioni di pulcino infetti, ottenere CAO e liquido allantoico.

4. Metti un gocciolamento RHA con liquido allantoico.

Lavoro indipendente degli studenti:

a) preparazione dei luoghi di lavoro e delle tute per l'apertura degli embrioni di pollo infettati nella lezione precedente;

b) autopsia di embrioni di pollo infettati dal virus della malattia di Newcastle, aspirazione di liquidi allantoici e amniotici, stadiazione di fleboclisi RGA;

c) apertura di embrioni di pollo infettati dal virus del vaiolo, estrazione di CAO, conteggio e prelievo di butterature;

d) preparazione per la disinfezione di strumenti, embrioni, piatti.

1. Cosa sai dei metodi di rilevamento dei virus negli embrioni di pollo?

2. Quali metodi conoscete per ottenere materiale contenente virus da embrioni di pollo?

3. Quali sono le proprietà emoagglutinanti dei virus e i loro usi? Qual è il meccanismo dell'emoagglutinazione?

Scopo della lezione: studiare diversi tipi di culture, la loro nomenclatura. Studiare il materiale di supporto nella produzione di colture cellulari.

Attrezzature e materiali: Le soluzioni di Hank. Earl, terreno nutritivo 199, ago, idrolizzato di lattoalbumina, materassi, fiale, vetreria, colture cellulari pronte all'uso, apparecchiature multimediali, presentazioni Microsoft OfficePowerPoint sull'argomento della lezione.

Spiegazione dell'insegnante. La coltivazione di colture cellulari per la produzione di vari prodotti biologici, ricerca o lavoro diagnostico è un momento rivoluzionario del XX secolo. Il riconoscimento dell'idea che le cellule dei tessuti degli animali superiori possano essere isolate dal corpo e quindi creare le condizioni per la loro crescita e riproduzione in vitro risale al primo decennio del XX secolo. Dopo che si è saputo che tali processi sono reali, è iniziata la seconda fase del lavoro: la coltivazione delle cellule e la riproduzione dei virus in esse. Il terzo e il quarto stadio iniziano con l'avvento della capacità di inserire geni ottenuti esogenamente nelle cellule e ottenere la loro espressione e la conferma della possibilità di far crescere un'intera popolazione da una singola cellula (ibrido), che segnano la possibilità di ottenere sistemi transgenici e clonazione di organismi Attualmente, nessun laboratorio virologico può fare a meno della coltura cellulare Le colture cellulari hanno quanto segue vantaggi prima degli animali da laboratorio e degli embrioni di pollo:

è possibile ottenere l'infezione di quasi tutte le colture cellulari, il che consente di ottenere materiale contenente virus con la più alta concentrazione di virus con il più basso contenuto di zavorra proteica;

poiché è possibile ottenere colture cellulari di qualsiasi tipo di animale, vengono rimosse le restrizioni di specie sulla coltivazione dei virus;

è possibile intervenire nel processo infettivo in qualsiasi momento senza violare l'integrità del sistema vivente;

puoi monitorare continuamente il corso del processo infettivo;

è possibile ottenere una pronta sospensione del virus sotto forma di liquido di coltura;

si osserva la completa sterilità del liquido di coltura nei confronti di funghi e batteri;

tecnica estremamente semplice di infezione e ottenimento di materiale contenente virus;

economicità relativa.

Le colture cellulari sono il sistema di laboratorio più avanzato per la coltura dei virus. Nella pratica virologica, le colture cellulari sono spesso utilizzate per il rilevamento primario di virus e il loro isolamento da materiale patologico, l'accumulo del virus nella produzione di vaccini e diagnostica, il mantenimento di ceppi virali in laboratorio, la titolazione di virus, e come oggetto di prova nella reazione di neutralizzazione.

Per un corretto isolamento del virus, è necessario osservare quanto segue: requisiti:

la coltura cellulare utilizzata deve essere suscettibile al virus sospetto. La sua sensibilità aumenta se le cellule sono ottenute da animali giovani (preferibilmente embrioni);

10.1 Tipi di colture cellulari. La coltura cellulare è costituita dalle cellule di un organismo multicellulare che vivono e si moltiplicano in condizioni artificiali al di fuori del corpo (in vitro).

La tecnica della coltivazione cellulare iniziò a svilupparsi con particolare successo dopo gli anni '40 del secolo in corso. Ciò è stato facilitato dalle seguenti circostanze: la scoperta di antibiotici che prevengono l'infezione batterica delle colture cellulari, la scoperta da parte di Huang (1943) e Enders (1949) della capacità dei virus di provocare una specifica distruzione cellulare (effetto citopatico) - un metodo conveniente per indicare i virus nelle colture cellulari e, infine, Dulbecco e Vogt (1952) hanno proposto una tecnica per la tripsinizzazione dei tessuti e l'ottenimento di colture cellulari a strato singolo.

Nella pratica virologica vengono utilizzate le seguenti colture cellulari.

Colture cellulari primarie tripsinizzate- cellule ottenute direttamente da organi o tessuti del corpo, che crescono in vitro in uno strato (Fig. 26). La coltura cellulare può essere ottenuta praticamente da qualsiasi organo o tessuto di un essere umano o animale (adulto o embrione). Tuttavia, questo può essere fatto meglio dagli organi embrionali, poiché le cellule degli embrioni hanno un potenziale di crescita più elevato. Molto spesso, per questi scopi vengono utilizzati reni, polmoni, pelle, timo, testicoli di embrioni o giovani animali.

Figura 26. Coltura primaria di cellule polmonari di un embrione di pecora (secondo Trotsenko N.I. et al.)

Per ottenere cellule primarie da un animale sano, entro e non oltre 2-3 ore dalla macellazione, vengono prelevati gli organi o i tessuti corrispondenti, tagliati a pezzi (1-4 mm) e trattati con enzimi: tripsina, pancreatina, collagenasi e altri (di solito tripsina). Gli enzimi distruggono le sostanze intercellulari, le singole cellule risultanti vengono sospese in un mezzo nutritivo e coltivate sulla superficie interna di provette o materassi in un termostato a 37 °C.

Le cellule si attaccano al vetro e iniziano a dividersi. Nello sviluppo delle colture cellulari si distinguono diverse fasi: adattamento, crescita logaritmica, stazionaria e invecchiamento (morte cellulare). Propagandosi, le cellule si depositano sulla superficie del vetro e, quando questo è completamente ricoperto da uno strato, entrano in contatto tra loro e smettono di dividersi (inibizione del contatto). Sul vetro si forma uno strato spesso una cellula (pertanto, queste colture cellulari sono chiamate a strato singolo o monostrato).

Tipicamente, un monostrato si forma dopo 3-5 giorni. La velocità della sua formazione dipende dal tipo di tessuto, dall'età dell'animale, dalla qualità del mezzo nutritivo, dalla concentrazione dell'inoculo delle cellule e da altri fattori.

Il mezzo nutritivo viene modificato man mano che viene contaminato dai prodotti dell'attività vitale cellulare. Il monostrato rimane vitale per 7-21 giorni (a seconda del tipo di cellule e della composizione del mezzo nutritivo).

L'intensità della riproduzione cellulare e lo stato del monostrato è controllato visivamente sotto un microscopio a basso ingrandimento (lente x10). È meglio usare un microscopio invertito per questo scopo.

Per la coltivazione dei virus vengono utilizzate colture cellulari giovani (non appena si è formato un monostrato).

Sottoculture. Nella pratica virologica si utilizzano spesso le sottocolture, che si ottengono da cellule primarie cresciute nei materassi prelevandole dal vetro con una soluzione di versene o tripsina, risospendendole in un nuovo mezzo nutritivo, e trasferendole in nuovi materassi o provette. Dopo 2-3 giorni si forma un monostrato.

In pratica, la sottocoltura può essere ottenuta da tutte le colture cellulari primarie. (I fibroblasti di pollo sono sottocoltivati ​​meno bene.) Le sottocolture sono suscettibili ai virus quanto le colture cellulari primarie, inoltre sono più economiche ed è possibile rilevare la contaminazione cellulare con virus. Le sottocolture si ottengono da 2-5 passaggi (inoculazioni) e molto raramente fino a 8-10. I passaggi successivi portano a un cambiamento nella morfologia cellulare e alla loro morte. .

Se le colture cellulari hanno superato più di 10 passaggi, sono già nella fase di transizione alle colture cellulari continue.

Colture cellulari continue Si tratta di cellule in grado di riprodursi al di fuori del corpo per un tempo indefinitamente lungo. Nei laboratori, sono supportati da trasferimenti da una nave all'altra (soggetto alla sostituzione del mezzo nutritivo).

Le cellule trapiantabili sono ottenute da colture cellulari primarie con una maggiore attività di crescita mediante lunghi passaggi in una certa modalità di coltivazione. Di solito, il lavoro per ottenere nuove linee cellulari richiede diversi mesi. Si ritiene che il meccanismo di origine delle colture cellulari trapiantate sia il risultato della variabilità genetica delle cellule o della selezione di singole cellule presenti nella coltura di origine primaria.

Le cellule delle colture trapiantate hanno la stessa forma, un insieme eteroploide di cromosomi (nelle cellule primarie è diploide), sono stabili in condizioni di crescita in vitro, alcune di esse hanno attività oncogenica. Quest'ultima proprietà limita l'uso di colture cellulari continue per la coltura di virus nella produzione di vaccini.

Le colture cellulari continue possono essere ottenute sia da tessuti animali sani sia da tessuti tumorali. Tra queste, le seguenti linee cellulari sono le più utilizzate: HeLa (da un tumore canceroso della cervice di una donna); Ner-2 (da carcinoma laringeo umano); KB (dal cancro orale); VNK-21 (rene di un criceto appena nato); PPES (rene trapiantato dell'embrione di maiale); PPT (rene di vitello trapiantato); PPO (rene di pecora trapiantato); TR (da mucosa tracheale bovina); L (fibroblasti di topo); SOC (dal cuore della scimmia cynomolgus), ecc.

Le cellule trapiantate presentano vantaggi rispetto a quelle primarie: la loro preparazione è molto più semplice, si risparmia lavoro e risorse materiali; queste colture possono essere controllate in anticipo per la presenza di virus latenti e microflora; le linee clonali forniscono condizioni più standard per la propagazione del virus rispetto alle linee primarie, che rappresentano una popolazione mista di cellule. La maggior parte delle cellule trapiantate ha uno spettro più ampio di suscettibilità al virus rispetto alle corrispondenti colture primarie.

Tuttavia, le cellule trapiantate presentano anche degli svantaggi: sono soggette a malignità, cioè degenerazione maligna, indipendentemente dall'origine, e una diminuzione della sensibilità ai virus in esse si verifica più rapidamente rispetto a quelle primarie, quindi è necessario utilizzare linee clonali di cellule trapiantate .

Mantenere le cellule trapiantabili mediante subcoltura periodica. Il metodo della centrifuga è più comunemente usato. Per la successiva risemina, viene selezionata una coltura di 2-3 giorni con un buon monostrato, il mezzo nutritivo viene drenato e il monostrato cellulare viene coperto con una soluzione di versene allo 0,02% riscaldata a 35-37°C. L'effetto disperdente di versen è dovuto al suo legame di cationi bivalenti (Mg ++ , Ca ++), che contribuiscono all'attaccamento delle cellule al vetro e garantiscono l'integrità della coltura cellulare. Sotto l'azione del versene, le cellule sono arrotondate, separate dal vetro.

Dopo 10-15 minuti dall'arrotondamento delle cellule, il versene viene drenato, lasciandone una piccola quantità (in un materasso da 1 litro - 5-10 ml, in un materasso da 0,1 litri - 2-3 ml), e incubato per altri 5-10 minuti, lavando periodicamente le cellule con versene, quindi aggiungere una piccola quantità di mezzo nutritivo. Dopo l'agitazione, le cellule vengono contate in una camera di Goryaev, la sospensione cellulare iniziale viene diluita con un mezzo nutritivo di crescita alla concentrazione richiesta (80-200 mila per 1 ml) e versata sotto agitazione in provette o materassi, chiusa con tappi di gomma e coltivato in termostato a 37 °C per 3-4 giorni fino alla formazione di un monostrato continuo. Di solito, le cellule nella camera di Goryaev non vengono contate, ma sottocoltivate con un rapporto da 1:2 a 1:6, a seconda del tipo di cellule. La composizione del mezzo nutritivo dipende anche dal tipo di cellule, ma i mezzi di Eagle, 199, o miscele di questi mezzi con idrolizzato di lattoalbumina sono più spesso utilizzati per la coltura di cellule trapiantabili.

È importante notare che quando si mantengono le cellule trapiantate mediante risemina sistematica in laboratorio, almeno un materasso viene lasciato senza riseminare nel caso in cui l'ultimo passaggio non sia idoneo.

colture di cellule diploidi. L'International Committee on Cell Cultures ha definito le cellule diploidi come segue: è una popolazione di cellule morfologicamente omogenea, stabilizzata durante la coltivazione in vitro, avente una durata di vita limitata, caratterizzata da tre fasi di crescita, che conserva durante il passaggio un cariotipo caratteristico del tessuto originario, esenti da contaminanti e non dotati di attività tumorigenica nel trapianto su criceti.

Le colture cellulari diploidi, così come quelle trapiantabili, sono ottenute da colture cellulari primarie. Il cariotipo cellulare è molto labile e, con i metodi convenzionali di coltura cellulare, cambia nei primi giorni. Pertanto, per il mantenimento a lungo termine delle cellule in vitro in uno stato diploide, erano necessari metodi speciali di elaborazione dei tessuti, terreni nutritivi di alta qualità e siero fetale. Questo problema fu risolto per la prima volta con successo dagli scienziati americani Hayflick e Moorhead (1961).

Le cellule diploidi sono state ottenute da vari tessuti di un embrione umano (polmoni, reni, tessuto muscoloscheletrico, cuore, ecc.) E animali (rene di un embrione di bovini, maiali, VNK-21 - rene di criceto, ecc.).

Le cellule diploidi, contrariamente a quelle trapiantate, hanno limitate possibilità di passaggio. Il numero massimo di passaggi è 50±10, quindi il numero di cellule in divisione diminuisce bruscamente e muoiono. Tuttavia, le cellule diploidi possono essere utilizzate a lungo, poiché ad ogni passaggio una parte delle cellule può essere congelata (meno 196 °C) e, se necessario, ripristinata.

Le cellule diploidi presentano vantaggi rispetto alle cellule trapiantate e primarie: 10-12 giorni possono essere in uno stato vitale senza cambiare il mezzo nutritivo; quando si cambia mezzo una volta alla settimana, rimangono vitali per 4 settimane; sono particolarmente adatti per la coltivazione a lungo termine di virus, mantengono la sensibilità del tessuto originale ai virus.

Colture cellulari in sospensione. Nel 1953, Owen et al. ha mostrato la capacità delle cellule di proliferare in uno stato di sospensione libera. Negli anni successivi, questo metodo è stato notevolmente migliorato: sono state create attrezzature moderne per garantire la riproduzione di cellule con parametri rigorosamente specificati (temperatura, pH, velocità di agitazione) e molte linee di cellule trapiantate sono state adattate alla riproduzione in queste condizioni (VNK-21 , Ner-2 , MDVK, ecc.). La crescita dei virus nelle colture in sospensione cellulare apre grandi opportunità nella produzione industriale di vaccini e diagnostica. Tuttavia, solo le cellule trapiantabili sono ben coltivate in sospensione.

Un nuovo approccio alla coltura di cellule in sospensione è l'utilizzo di microcarriers (sephadex, gel di silice, cytolar, ecc.). Sui microcarrier, le cellule in coltura formano un monostrato. Pertanto, questo metodo consente la crescita di cellule dipendenti dall'attaccamento a un substrato solido utilizzando metodi di coltura in sospensione: primari, sottoculture, diploidi. Queste cellule sono chiamate dipendenti dalla superficie.

Il metodo di coltivazione su microcarrier (Fig. 27) è attualmente estremamente diffuso, poiché apre grandi prospettive nella biotecnologia cellulare, nella produzione di vaccini e di altre sostanze biologicamente attive (interferone, ormoni, ecc.).

Figura 27. Coltivazione di cellule su microportatori (schema)

10.2 Conservazione delle colture cellulari. Ciascuno dei tre tipi principali di colture cellulari - colture primarie, ceppi diploidi e linee cellulari continue utilizzate nella ricerca virologica - spesso deve essere conservato, in quanto vi è il rischio di contaminazione batterica e di cambiamenti (genetici) incontrollati nelle cellule stesse durante passaggio a lungo termine di cellule in vitro.

Il metodo più semplice per conservare le colture cellulari consiste nel conservarle a 4°C per un massimo di 1–6 settimane. Lo stoccaggio di ceppi cellulari in condizioni di ghiaccio secco (meno 78 °C) e azoto liquido (meno 196 °C) viene utilizzato con successo. Per fare ciò, le cellule vengono rimosse dai materassi, sospese a una concentrazione di 106 in 1 ml di un mezzo nutritivo contenente il 10-40% di siero e il 10% di glicerolo sterile purificato come sostanze protettive (il DMSO, dimetilsolfossido, viene utilizzato con successo al posto di Glicerina). Quindi la sospensione cellulare viene versata in fiale, sigillate e conservate per 1–3 ore a 4°C, dopodiché le cellule vengono congelate in una miscela di etanolo e ghiaccio secco. La velocità di raffreddamento non deve superare 1 °C in 1 min. Quando la temperatura scende a meno 25 °C, le fiale vengono poste in ghiaccio secco per la conservazione. Se si utilizza azoto liquido per la conservazione, le fiale con le cellule vengono raffreddate a meno 70 °C e poste in azoto liquido. La conservazione delle cellule in azoto liquido per un certo numero di anni non modifica la loro attività proliferativa e la sensibilità ai virus.

Le cellule congelate vengono ripristinate come segue: un'ampolla con cellule congelate viene rapidamente immersa in un bagno d'acqua per 1-2 minuti con un leggero scuotimento, quindi le cellule vengono versate in un materasso, viene aggiunta una quantità appropriata di terreno di crescita e coltivate in un termostato a 37°C. Per rimuovere glicerolo o DMSO, il terreno di coltura viene sostituito il giorno successivo all'inoculazione.

Durante il trasporto delle celle, i materassi con un monostrato cresciuto vengono riempiti con il mezzo verso l'alto e chiusi con un tappo di gomma. In laboratorio, il terreno di coltura viene scartato e utilizzato nella coltura di queste cellule come supplemento al terreno di coltura utilizzato in laboratorio.

La sospensione cellulare può anche essere trasportata a 4°C. In condizioni di trasporto favorevoli, escludendo il surriscaldamento e il congelamento delle celle, l'80-90% di esse rimane vitale fino a 7-8 giorni.

Lavorare con la coltura cellulare richiede sterilità assoluta, un'attenta preparazione dei piatti, soluzioni appropriate, mezzi nutritivi e acqua di alta qualità.

10.3 Contaminazione di colture cellulari. Lavorare con colture cellulari, il loro uso in studi virologici e di altro tipo, in biotecnologia richiede un monitoraggio costante per l'assenza di agenti estranei (contaminanti). I contaminanti possono essere virus, batteri, funghi, micoplasmi e cellule di altre colture cellulari. I micoplasmi sono uno dei contaminanti più comuni, specialmente nelle linee cellulari trapiantate. Il rilevamento tempestivo di loro, altri microrganismi o virus nella coltura cellulare è una condizione importante per mantenere l'alta qualità di quest'ultimo. La certificazione di linee cellulari stabili prevede, come test necessario, il controllo dell'assenza di contaminazione micoplasmatica, che dovrebbe diventare obbligatorio per tutti i laboratori che lavorano con colture cellulari.

Una forte acidificazione del mezzo nutritivo nei flaconi di coltura e la sua opalescenza possono essere il risultato della contaminazione delle colture cellulari con micoplasmi. Per l'identificazione di quest'ultimo vengono utilizzate le seguenti metodiche: inoculazione su terreno nutritivo, colture di prova, microscopia citologica, radioautografica ed elettronica.

In caso di contaminazione, le colture cellulari vengono distrutte e la coltivazione viene ripresa dalle covate di riserva conservate in azoto liquido. Solo le colture rare e uniche sono soggette a decontaminazione.

È possibile prevenire la riproduzione e sopprimere i batteri che entrano accidentalmente nella coltura cellulare con l'aiuto di farmaci antimicrobici (antibiotici, ecc.) aggiunti ai terreni di crescita immediatamente prima del loro utilizzo. Questi farmaci devono essere rigorosamente dosati e applicati in modo differenziato. Il loro uso è una condizione necessaria quando aumenta il rischio di contaminazione nel processo di ottenimento di colture cellulari primarie nella coltivazione in sospensione cellulare su larga scala, nella coltivazione di produzione di massa di cellule trapiantabili e anche in tutti i casi di combinazione di materiale cellulare.

Quando si lavora con colture cellulari, molti farmaci antimicrobici (non tossici) vengono utilizzati in dosi ottimali, la cui natura è mostrata nella Tabella 5. La scelta di un farmaco efficace o di una combinazione di farmaci dipende dalla sensibilità di specifici contaminanti ad essi .

Tabella 5

Antimicrobici per colture cellulari (L.P. Dyakonov et al.)

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coltura di cellule virali

introduzione

1. Tipi di colture cellulari

2. Terreni nutritivi

4.1 Rilevamento virus

Bibliografia

introduzione

Per l'accumulo quantitativo di virus, le colture cellulari sono il sistema più conveniente. I primi tentativi di coltivare cellule animali al di fuori del corpo risalgono alla fine del secolo scorso. Queste osservazioni frammentarie indicavano la possibilità di preservare la vitalità di tessuti e cellule in condizioni artificiali e segnarono l'inizio di una profonda ricerca scientifica sulle colture di tessuti.

Un grande merito nello sviluppo di metodi per coltivare i tessuti spetta a Carrel, che fu il primo a dimostrare la possibilità di riproduzione di cellule animali in condizioni artificiali, dimostrando così la loro "immortalità" e somiglianza con organismi unicellulari a vita libera. Progressi significativi in ​​questa direzione sono stati compiuti da un gruppo di ricercatori guidati da Earl. Sono stati i primi ad ottenere la crescita di un gran numero di cellule su vetro e in sospensione liquida agitata. L'avvento degli antibiotici e i progressi nei mezzi di coltura artificiali hanno inaugurato una nuova era nello sviluppo delle tecniche di coltura dei tessuti.

Le colture di tessuti sono state a lungo utilizzate per risolvere vari problemi in biologia e medicina. Tuttavia, solo i successi nel campo della virologia raggiunti con l'aiuto delle colture di tessuti sono stati un potente stimolo per il loro sviluppo fino al livello attuale.

La coltivazione di virus aiuta a risolvere una serie di problemi teorici associati allo studio delle caratteristiche dell'interazione "virus-cellula". Inoltre, la soluzione di una serie di problemi applicati relativi alla diagnosi e alla produzione di farmaci per la prevenzione delle infezioni virali è impossibile senza l'accumulo di materie prime contenenti virus.

1. Tipi di colture cellulari

Il trasferimento delle cellule di un intero organismo alle condizioni di vita in vitro cessa la loro esistenza come uno dei numerosi elementi strutturali del tessuto o dell'organo in cui erano precedentemente incluse. Allo stesso tempo, le cellule sfuggono al controllo dei fattori neuroumorali e acquisiscono una serie di caratteristiche che dipendono sia dal fatto stesso del rigetto cellulare da questi tessuti sia dalle condizioni specifiche della loro esistenza in vitro.

Le cellule oi tessuti che vivono al di fuori del corpo sono caratterizzati da un intero complesso di caratteristiche metaboliche, morfologiche e genetiche che sono nettamente diverse dalle proprietà delle cellule di organi e tessuti in vivo.

Diversi tipi di tessuti e colture cellulari sopravvissuti e in crescita si distinguono a seconda del metodo di espianto primario del tessuto e della tecnica della sua coltivazione. Le colture a strato singolo e in sospensione di cellule in crescita sono le più utilizzate. Costituiscono la base della moderna pratica virologica di laboratorio e industriale.

Esistono due tipi principali di colture cellulari a strato singolo: primarie e trapiantate.

Il termine "primario" si riferisce a una coltura cellulare ottenuta direttamente da tessuti umani o animali nel periodo embrionale o postnatale. La durata della vita di tali colture è limitata. Dopo un certo tempo compaiono in esse fenomeni di degenerazione aspecifica, che si esprime in granulazione e vacuolizzazione del citoplasma, arrotondamento delle cellule, perdita di comunicazione tra le cellule e il substrato solido su cui sono cresciute. Il cambio periodico del mezzo, i cambiamenti nella composizione di quest'ultimo e altre procedure possono aumentare solo leggermente la durata della coltura cellulare primaria, ma non possono impedirne la distruzione e la morte finali. Con ogni probabilità, questo processo è associato alla naturale estinzione dell'attività metabolica delle cellule che sono fuori controllo dei fattori neuroumorali che agiscono nell'intero organismo.

Solo singole cellule o gruppi di cellule nella popolazione sullo sfondo della degenerazione della maggior parte dello strato cellulare possono mantenere la capacità di crescere e riprodursi. Queste cellule, avendo trovato la potenza della riproduzione infinita in vitro, danno origine a colture cellulari trapiantate dopo ripetute inoculazioni.

Ci sono linee e ceppi di cellule trapiantate. Il primo termine si riferisce a cellule trapiantabili caratterizzate da potenziale immortalità e, di regola, un cariotipo eteroploide; il secondo termine si riferisce a cellule semi-trapiantabili con un corredo diploide di cromosomi e una durata di vita limitata in vitro. La comparsa sia di queste che di altre cellule è associata al processo di selezione nella popolazione cellulare delle colture primarie, che sono quindi la fonte di tutte le linee e ceppi di cellule trapiantate.

Il vantaggio principale delle linee cellulari trapiantabili, rispetto a qualsiasi coltura primaria, è il potenziale di riproduzione illimitata al di fuori del corpo e la relativa autonomia che le avvicina ai batteri e ai protozoi unicellulari.

La capacità delle cellule trapiantate di riprodursi all'infinito in vitro segna un salto qualitativo, a seguito del quale le cellule acquisiscono la capacità di un'esistenza autonoma, simile ai microrganismi cresciuti su mezzi nutritivi artificiali. La totalità dei cambiamenti che portano alla comparsa di tali caratteristiche nelle cellule è chiamata trasformazione e le cellule delle colture di tessuti trapiantate sono chiamate trasformate.

I miglioramenti nelle tecniche di coltura cellulare hanno notevolmente ampliato le possibilità di ottenere linee cellulari trapiantabili da un'ampia varietà di tessuti animali e umani. Allo stesso tempo, non è stato trovato alcun limite di età, oltre il quale i tessuti perderebbero la capacità di adattarsi a una crescita illimitata in vitro, cioè. alla trasformazione.

Un'altra fonte di linee cellulari trapiantate sono le neoplasie maligne. In questo caso, la trasformazione cellulare avviene in vivo come risultato dello sviluppo di un processo patologico, la cui eziologia rimane in gran parte poco chiara.

Non tutte le neoplasie maligne sono in grado di dare origine a colture cellulari trapiantabili. Quindi, ad esempio, sono stati fatti tentativi infruttuosi di ottenere cellule trapiantabili da tumori cancerosi dello stomaco umano e delle ghiandole mammarie. È difficile adattare alla vita in vitro le cellule del carcinoma a cellule squamose della pelle e delle mucose. D'altra parte, le linee sono relativamente facilmente derivate dai tessuti dei sarcomi e dei tumori maligni del sistema nervoso.

2. Terreni nutritivi

In ogni coltura cellulare ci sono fasi cellulari e liquide. La fase liquida garantisce l'attività vitale delle cellule di coltura ed è un mezzo nutritivo di varia composizione e proprietà.

Tutti i media in base al loro scopo sono divisi in crescita e supporto. La composizione dei terreni di coltura dovrebbe contenere più sostanze nutritive per garantire la moltiplicazione attiva delle cellule per formare un monostrato sulla superficie del vetro o una concentrazione sufficientemente elevata di elementi cellulari in sospensione (quando si ottengono colture in sospensione). Infatti, i terreni di supporto dovrebbero garantire solo la sopravvivenza delle cellule in un monostrato già formato durante la riproduzione degli agenti virali nelle cellule.

I mezzi di crescita e di supporto sono multicomponenti. Possono comprendere sia prodotti naturali (liquidi amniotici, sieri animali), sia substrati ottenuti a seguito di parziale lavorazione di prodotti naturali (estratti embrionali, idrolizzato di lattoalbumina, emoidrolizzato, aminopeptidi, ecc.), sia sostanze sintetiche chimicamente pure (ammino acidi, vitamine, sali).

Come esempio di terreno nutritivo costituito interamente da componenti naturali, si può citare il terreno di Buckley, proposto per coltivare colture cellulari dall'epitelio renale delle scimmie. Questo terreno include liquido amniotico bovino (85%), siero di cavallo (10%) ed estratto fetale bovino (5%).

Tutti i prodotti naturali sono di basso livello, il loro uso è associato a un grande pericolo di contaminazione microbica e virale delle colture cellulari. A questo proposito, vengono gradualmente sostituiti da miscele standard sintetiche. Il mezzo sintetico 199 e il mezzo ad ago trovano la massima applicazione. I terreni contenenti quantità rigorosamente definite di sali, amminoacidi e vitamine sono ampiamente utilizzati.

Indipendentemente dall'uso previsto, tutti i terreni di coltura tissutale sono progettati con una sorta di soluzione salina bilanciata con un'adeguata capacità tampone. Molto spesso sono soluzioni di Hanks e Earl. Queste soluzioni sono una componente essenziale di qualsiasi mezzo nutritivo. Un componente integrale della maggior parte dei terreni di crescita è il siero animale (vitello, bovino, cavallo), senza la presenza del 5-10% del quale non si verifica la riproduzione cellulare e la formazione di monostrati.

L'inclusione del siero allo stesso tempo impedisce la creazione di mezzi di crescita di precisa composizione chimica, che sono molto importanti per lo sviluppo della ricerca fondamentale nella fisiologia cellulare, poiché insieme al siero (o ai suoi derivati) viene introdotto un intero complesso di fattori incontrollabili , che variano a seconda della serie di siero.

Negli anni '50, Ewans e Waymouth proposero terreni privi di siero di esatta composizione chimica. Tuttavia, questi terreni non fornivano quegli indicatori di attività proliferativa cellulare che determinano i terreni con l'aggiunta di sieri. A questo proposito, è interessante il lavoro di Birch e Pirt, i quali hanno dimostrato che l'inclusione di sali solfati di Fe, Zn, Cu e anche MnC1 2 è decisiva per garantire una crescita cellulare intensiva in terreni privi di siero.

Gli antibiotici vengono aggiunti ai mezzi di crescita, nonché alla soluzione tampone per il lavaggio dei tessuti. Vengono introdotti nel terreno immediatamente prima dell'uso alla velocità di 1 ml di soluzione madre di antibiotici per 500 ml di terreno.

Di seguito è riportata la composizione e il metodo di preparazione di uno dei comuni mezzi di coltura.

Mercoledì Ago

l-arginina - 17.4

l-cistina - 4.8

l-istidina - 3.1

l-isoleucina - 26.2

l-leucia - 13.1

l-lisina - 14.6

l-metionina - 7,5

l-fenilalanina - 8.3

l-treonina - 11.9

l-triptofano - 2.0

l-tirosina - 18.1

l-valina - 11.7

biotina - 0,24

colina - 0,12

cloruro di colina - 0,14

vitamina B 12 (acido pteroilglutammico) - 0,44

nicotinammide - 0,12

acido pantotenico - 0,22

pantotenato di calcio - 0,48

piridossale (piridossina cloridrato) - 0,20

cloridrato di tiamina - 0,34

riboflavina - 0,04

cloruro di sodio - 5850.0

cloruro di potassio - 373,0

fosfato di sodio monosostituito (NaH 2 PO 4. H 2 O) - 138,0

cloruro di calcio - 111,0

bicarbonato di sodio (NaHCO 3) - 1680,0

cloruro di magnesio (MgCl 2. 6H 2 O) - 102,0

glucosio - 900,0

l-glutammina - 146,2--292,3

penicillina - 50,0

streptomicina - 50,0

rosso fenolo - 5.0

acqua fino a 1000.0

Cucinando.

Soluzione 1. In 500 ml di acqua riscaldata a circa 80°, si sciolgono sotto agitazione le suddette quantità di amminoacidi, dopodiché si aggiungono l-glutammina e rosso fenolo.

Soluzione 2. In 100,0 ml di acqua sciogliere i sali inorganici, ad eccezione del bicarbonato di sodio (NaHCO 3 ), miscelare con la precedente soluzione di sali inorganici, aggiungere biotina e vitamina B 12 .

Soluzione 3. Tutte le vitamine vengono sciolte in 200,0 ml di acqua, ad eccezione della biotina e dell'acido ptero-ilglutammico e degli antibiotici - penicillina e streptomicina. Tutte le soluzioni vengono sterilizzate mediante filtrazione attraverso un filtro di aspirazione in vetro (lastra di vetro poroso, dimensione dei pori 0,7--1,5) o attraverso lastre di cellulosa di amianto Seitz dopo il lavaggio preliminare con acqua e quindi con la soluzione preparata.

Miscelare 500 ml di soluzione 1 + 200 ml di soluzione 2 + 200 ml di soluzione 3 e diluire a 1000,0 ml con acqua sterile. Puoi aggiungere 1 mg di inositolo per 1 litro.

3. Ottenere colture cellulari

3.1 Preparazione di colture cellulari primarie

Primario - si chiama coltura ottenuta da tessuto e coltivata in vitro prima dell'inizio della subcoltura, cioè prima del primo raccolto. La coltura primaria è priva di molte delle cellule presenti nel tessuto originale, poiché non tutte le cellule sono in grado di aderire al substrato e sopravvivere in vitro. Nel processo di coltura cellulare, la coltura è relativamente priva di cellule che non si dividono o che si dividono lentamente.

Nella prima fase dell'ottenimento di una coltura primaria, viene eseguita una rimozione sterile di un frammento di tessuto, un organo animale e la sua disaggregazione meccanica o enzimatica. Il tessuto viene frantumato in pezzi con un volume fino a 1-3 mm, i pezzi di tessuto vengono lavati dagli eritrociti con la soluzione di Hank con antibiotici. Tripsina (0,25% grezza o 0,01-0,05% purificata) o collagenasi (200-2000 unità/ml, grezza) e altri enzimi proteolitici vengono utilizzati per la disaggregazione dei tessuti. Questo metodo per ottenere la coltura fornisce un'elevata resa di cellule.

Le colture primarie possono anche essere ottenute da pezzi di tessuto di 1 mm che aderiscono alla superficie del substrato a causa della loro stessa adesività o della presenza di tacche sul piatto, o utilizzando un coagulo di plasma. In questi casi, le cellule cresceranno dai frammenti. Le cellule che migrano dagli espianti possono essere utilizzate per il passaggio. I frammenti di tessuto (espianti) vengono trasferiti su nuove piastre, le cellule in migrazione possono essere rimosse mediante sottocoltura, una miscela di versene e tripsina e gli espianti rimanenti formeranno nuove escrescenze.

Sono note colture primarie come colture di fibroblasti di embrioni di pollo, colture di cellule renali di vitello e leucociti.

3.2 Ottenere colture cellulari continue monostrato

Come notato sopra, uno dei metodi per ottenere linee cellulari trapiantabili è la selezione di cellule con aumentata attività di crescita e riproduzione dalla popolazione di colture primarie. La selezione può essere effettuata cambiando regolarmente l'ambiente, lavando il monostrato della coltura cellulare primaria tripsinizzata. Per questo vengono selezionati materassi con un monostrato cellulare ben formato (i materassi stessi devono avere un fondo piatto e non devono presentare graffi e macchie opache sulle pareti). Il terreno di coltura preparato per un cambiamento sistematico viene versato in piccoli vasi (per escludere la contaminazione batterica) e conservato a t - 4 °.

Il mezzo viene cambiato regolarmente, almeno una volta alla settimana. Durante le prime 3 settimane, viene sostituito il 20-30% del volume del mezzo di crescita, durante le successive 3-4 settimane - 50-60%, successivamente viene effettuato un cambio completo del mezzo. L'ambiente fresco immediatamente prima del lavoro viene riscaldato a t - 37 °.

Quando i media cambiano, le cellule cambiano la loro morfologia. Alcune celle sono arrotondate e cadono dal vetro. La maggior parte delle cellule si restringe verso il centro e il monostrato acquista un aspetto stellato. Le cellule stesse sono leggermente allungate. Dopo 7-10 cambiamenti dell'ambiente nei materassi, di norma, iniziano a comparire nuovi elementi cellulari e in culture diverse hanno una morfologia diversa.

Nella coltura di cellule renali embrionali di pollo, al centro del monostrato o tra le sue aree contratte compaiono elementi cellulari arrotondati, da cui si formano gradualmente grappoli sotto forma di piccole colonie. Nella coltura delle cellule renali di scimmia compaiono singole formazioni simili a grani. Le cellule sono strettamente adiacenti l'una all'altra, formando piccole colonie trasparenti. Il numero di tali cellule aumenta lentamente, anche la dimensione delle colonie quasi non aumenta. Le colonie compaiono non solo sul fondo del materasso, ma anche sulle superfici laterali, al confine del mezzo nutritivo. Pertanto, un prerequisito per cambiare il mezzo nutritivo è mantenere il suo volume costante. Nella coltura di cellule renali embrionali umane sullo sfondo della degenerazione di massa del monostrato ristretto in filamenti, vengono rivelate grandi cellule poligonali con lunghi processi.

Gli elementi cellulari atipici che si sono formati durante il processo di selezione devono essere separati dal resto del monostrato e trasferiti in provette o materassini separati. Per questo, può essere utilizzato il metodo di versenizzazione o scissione meccanica di cellule atipiche utilizzando un'ansa batteriologica o una spatola. Quest'ultimo metodo è particolarmente necessario quando si lavora con una coltura cellulare di reni di scimmia, dove le colonie di cellule atipiche sono strettamente attaccate al vetro e non si separano da esse stesse.

Quando si cambia il mezzo nutritivo in caso di comparsa di cellule atipiche, si consiglia di rimuovere con cura la maggior parte del mezzo di crescita e, con una parte minore, sciacquare vigorosamente il monostrato e versare questo mezzo nelle provette. In questo caso, nel terreno possono comparire cellule atipiche che hanno la capacità di formare colonie idonee per ulteriori sottocolture.

Dopo aver trasferito la coltura di cellule atipiche in una nuova piastra, è consigliabile continuare a monitorare la coltura principale, poiché il processo di allevamento di una nuova linea cellulare è molto complicato e non sempre gli elementi atipici selezionati danno origine a una linea vitale di cellule trapiantate . È necessario che tutto il lavoro per ottenere nuove linee cellulari, che dura molti mesi, sia svolto con gli stessi mezzi nutritivi, sieri animali e serie di antibiotici.

Sono note colture primarie come la coltura di cellule renali di criceto dorato (BHK), la coltura di cellule renali di stambecco di montagna siberiano (PSGC), la coltura di cellule renali di scimmia verde (CV).

3.3 Coltura cellulare a rullo

Fino a poco tempo fa, le colture tissutali venivano utilizzate in virologia principalmente sotto forma di colture stazionarie a strato singolo. In molti casi, questo metodo di coltura cellulare è indispensabile. Molti anni di esperienza dimostrano che quando si utilizzano colture fisse a strato singolo, si incontrano numerose difficoltà, associate a enormi spese di tempo di lavoro e materiali. Da questo punto di vista, le colture a rullo sono più redditizie, che sono economiche, caratterizzate da un rapporto ottimale tra l'area utile di coltivazione e il volume del mezzo nutritivo e aprono opportunità favorevoli per l'accumulo di massa cellulare.

Il termine "coltura a rulli" si riferisce a un metodo di coltura in cui un monostrato cellulare si trova sull'intera superficie cilindrica di recipienti rotanti orizzontalmente e viene periodicamente lavato con un mezzo nutritivo. Per determinati motivi, in alcuni casi è possibile pesare un certo numero di cellule nel terreno di coltura. In questa forma di realizzazione, la coltura cellulare è chiamata sospensione a rulli. La "resa" della coltura cellulare sarà tanto maggiore quanto maggiore è l'area da cui vengono raccolte le cellule. I ricercatori hanno usato vari modi per aumentare la superficie su cui le cellule possono attaccarsi e moltiplicarsi. Per fare questo sono state utilizzate varie basi con una grande superficie specifica: dure, spugnose, di lana, di collagene, su spirali di vetro, ecc. essere notato descritto da L. S. Ratner e V. A. Krikun metodo di coltivazione a più livelli. Le cellule sono state coltivate in bottiglie da 1,5, 10 e 15 litri completamente caricate con tubi di vetro ovali paralleli all'asse longitudinale dei vasi. In questo caso, l'area utile è aumentata di 20 volte rispetto alle colture monostrato stazionarie in recipienti dello stesso volume. La coltivazione è avvenuta in 2 fasi. Nella prima fase, le bottiglie sono state ruotate attorno ad un asse orizzontale per distribuire uniformemente le celle. Successivamente, quando le cellule sono state attaccate al vetro, la coltura è proseguita in posizione stazionaria. Il sistema di coltura descritto è stato utilizzato con successo per la coltivazione dell'afta epizootica.

La rotazione dei vasi in cui si moltiplicavano le cellule si è rivelata più efficace. Inizialmente, le cellule venivano coltivate in provette, ma con lo sviluppo di attrezzature tecniche, il volume dei recipienti di coltura è aumentato ei ricercatori sono passati dalla coltivazione di cellule in provette rotanti a bottiglie rotanti. Le colture a rullo iniziarono ad essere utilizzate sia per l'accumulo di cellule che per la propagazione dei virus.

Per la coltivazione a rulli vengono utilizzati speciali apparecchi a cremagliera per la rotazione di bottiglie o fusti. Molto spesso, per la coltivazione vengono utilizzate bottiglie da 0,5-3 litri. In condizioni di produzione, il loro volume può raggiungere i 20 litri o più. Gli apparati di coltura a rullo sono semplici, affidabili e di facile manutenzione. Di grande importanza è la velocità di rotazione delle bottiglie. Non deve essere troppo alto, per non impedire l'attaccamento cellulare, ma nemmeno troppo basso, poiché l'esposizione prolungata delle cellule alla fase gassosa peggiora le loro condizioni nutrizionali. Nelle opere di vari autori la velocità di rotazione delle bottiglie variava da 8-12 giri/min a 1 giri/min. La più adatta per varie colture cellulari era la velocità di rotazione delle fiale nell'intervallo di 0,5-1 rpm. Consigliato entro i primi 30 minuti. dopo aver seminato le cellule, garantire un'elevata velocità di rotazione delle fiale (0,5-1,0 giri/min) per una distribuzione uniforme dei materiali, quindi trasferirli a una bassa velocità di rotazione (20-30 giri/min).

La concentrazione di semi in 1 ml di terreno è di 60-80 mila per le cellule SPEV, VNK-21, HeLa, L, 100-200 mila per le cellule diploidi e 200-300 mila per le colture primarie. essere 1/10, 1/20 del volume di una bottiglia a rullo. Il metodo di coltivazione a rullo consente di ottenere un numero maggiore di celle. Pertanto, da una fiala con una capacità di 3 l, è possibile ottenere un raccolto di cellule HeLa di 8 volte, VNK-21 - di 9 volte, AO - 11 volte maggiore rispetto a una coltura fissa monostrato di una fiala con un capacità di 1 litro. La molteplicità dei risparmi sui media quando si utilizzano fiale da 3 litri è 2,8 per le celle HeLa; VNK-21 - 5.0, AO - 4.0. La capacità di crescere e riprodursi in condizioni di rullo è posseduta da sottoculture, colture trapiantate e meno spesso ceppi di cellule primarie e diploidi. Per una migliore riproduzione delle cellule nei dispositivi a rulli, è necessario adattarli alle nuove condizioni di coltivazione. Il metodo della coltura a rullo consente di ottenere un gran numero di cellule. Il vantaggio delle colture a rullo rispetto alle tradizionali colture stazionarie è, in particolare, l'uso più economico dei mezzi nutritivi e una maggiore resa dell'antigene virale (di 1-2 lg).

3.4 Colture cellulari in sospensione

Nel 1953, Owens e collaboratori dimostrarono per la prima volta la capacità delle cellule di moltiplicarsi in un mezzo liquido in uno stato di sospensione libera. Da allora, il metodo della coltura in sospensione ha attirato l'attenzione dei ricercatori grazie alla sua elevata efficienza nell'accumulo di grandi quantità di cellule. Si è scoperto che le cellule delle linee trapiantate, a differenza di altri tipi di colture cellulari, possono essere coltivate a lungo in uno stato sospeso. Le cellule in queste condizioni si moltiplicano senza attaccarsi alle pareti del recipiente di coltura, essendo in uno stato di sospensione, a causa della costante miscelazione del terreno. Sotto il regime di crescita ottimale, le cellule in sospensione si moltiplicano rapidamente e hanno una "resa" maggiore rispetto alle colture stazionarie. Le linee cellulari primarie e continue hanno diverse capacità di crescere in sospensione. Pertanto, le linee permanenti eteroploidi e aneuploidi, contrariamente alle linee pseudodiploidi, si adattano più rapidamente alla crescita in sospensione.

Le colture in sospensione vengono preparate da colture monostrato. Le cellule vengono staccate dal vetro con soluzioni di versene e tripsina. Il pellet cellulare dopo la centrifugazione (1000 rpm) viene risospeso in mezzo nutritivo fresco. La sospensione preparata viene posta in recipienti di coltura (reattori, fermentatori) e fatta crescere con costante agitazione. Negli studi scientifici, la concentrazione di cellule nella sospensione iniziale varia da 0,3 a 10x10 per 1 ml. La concentrazione ottimale di cellule nella sospensione iniziale dovrebbe essere 2-5x10 per 1 ml. Secondo Earle ei suoi collaboratori, la concentrazione di cellule nella coltura sospesa dovrebbe essere tale che la fase di crescita logaritmica avvenga entro e non oltre 16-24 ore dalla preparazione della coltura. Le colture cellulari in sospensione attraversano stadi caratteristici: una fase di ritardo, una fase di crescita logaritmica, una fase stazionaria e una fase di morte logaritmica. Nella prima fase, di norma, il numero di cellule diminuisce, nella seconda fase la popolazione cellulare aumenta (fase di crescita logaritmica), nella terza fase non si osserva alcun aumento del numero di cellule (fase stazionaria). Se la coltivazione viene continuata ulteriormente, si riscontra un periodo di diminuzione del numero di cellule: la fase della morte logaritmica (la fase della distruzione). Il tasso di riproduzione cellulare nella fase di crescita logaritmica è espresso dal tempo di generazione. Il tempo di generazione si riferisce al periodo necessario per raddoppiare la popolazione di cellule in coltura. Per la coltura in sospensione cellulare, condizione importante è la miscelazione del liquido, che deve essere continua e sufficientemente intensa da mantenere le cellule in sospensione, evitare che si depositino e si attacchino alle pareti del vaso, e allo stesso tempo non provochino danni meccanici danno.

La miscelazione delle colture in sospensione viene effettuata con agitatori magnetici a lame e sedie a dondolo circolari. Attualmente è ampiamente utilizzata la rotazione di fiale e flaconi attorno all'asse longitudinale (15-40 rpm). Sugli agitatori magnetici, la velocità di rotazione è di 100-200 giri/min. La velocità di miscelazione dipende dal volume della coltura; piccoli volumi di coltura richiedono una bassa velocità, mentre deve essere aumentata a grandi volumi. La siliconizzazione viene eseguita per evitare che le cellule si depositino sulla superficie interna del recipiente. Il rivestimento in silicone, grazie alla sua idrofobicità, impedisce alle cellule di attaccarsi alla parete del vaso.

Le pareti interne del recipiente di coltura vengono inumidite con una soluzione di silicone al 5% o al 10% e, dopo l'evaporazione del solvente (benzene, acetone), i recipienti vengono mantenuti a 85°C e 200° (rispettivamente per 30 e 60 minuti). ). Dopo il raffreddamento, i recipienti vengono riempiti con acqua bidistillata calda e lasciati riposare per 2 ore, quindi vengono risciacquati 3 volte con acqua bidistillata ed essiccati a 100°C. I recipienti vengono sterilizzati in stufa a 170°C per 2 ore.

La massima crescita cellulare in sospensione si osserva a pH 7,0-7,2. I mezzi nutritivi utilizzati per far crescere le cellule in sospensione non differiscono dai mezzi utilizzati per far crescere le linee cellulari nella coltura monostrato. Molto spesso, quando si coltivano cellule in sospensione, il mezzo di Eagle viene assunto con una doppia concentrazione di aminoacidi e vitamine.

Le colture in sospensione consumano 2-7 volte più glucosio rispetto a quelle monostrato. Nel processo di consumo del glucosio, le cellule rilasciano acido lattico, tossico per loro, nell'ambiente. Il consumo di glucosio da parte delle cellule e la produzione di acido lattico sono paralleli e dipendono direttamente dalla densità della popolazione cellulare. Si è rivelato utile aggiungere insulina al mezzo nutritivo in una quantità da 40 a 200 UI per 1 litro. L'aggiunta di insulina al mezzo nutritivo modifica il rapporto tra la quantità di glucosio assorbito e la quantità di acido lattico rilasciato. Per le cellule L, questo coefficiente può essere ridotto dal 74-81 al 37-38%.

Diversi aminoacidi vengono consumati dal mezzo nutritivo facendo crescere le cellule a velocità diverse. Si noti che l'aggiunta regolare di arginina (20-40 mg/l) e l'aumento della quantità di glutammina a 450 mg/l favoriscono la crescita delle colture in sospensione.

L'aggiunta di inositolo (0,4 mg/l) accelera la crescita delle colture di cellule amniotiche umane. È desiderabile aggiungere catalasi (1 mg/l) e tiroxina (12 mg/l) al terreno.

Di grande interesse sono i lavori dedicati all'ottenimento di colture cellulari sospese in un mezzo sintetico che non contiene siero di sangue. Si sta tentando di aumentare la viscosità del mezzo nutritivo a scapito degli ingredienti privi di proteine. A tale scopo vengono utilizzati metilcellulosa e acido ialuronico.

La metilcellulosa ad una concentrazione dello 0,1-0,2% ha un effetto protettivo massimo sulle cellule sospese nel terreno. L'effetto protettivo della metilcellulosa è che le molecole formano uno strato protettivo attorno alla cellula, prevenendo il danno cellulare quando il mezzo viene agitato. Un indicatore molto importante dello stato della coltura in sospensione è la pressione parziale dell'ossigeno nella fase liquida. La concentrazione di ossigeno nella fase gassosa dipende dalla densità della popolazione cellulare ed è spesso inferiore a quella atmosferica. La mancanza di ossigeno porta alla comparsa della granulazione del citoplasma, le cellule perdono la loro regolare forma arrotondata. Con un leggero eccesso di ossigeno, le cellule hanno una forma ben definita, regolare, arrotondata e diventano molto grandi sotto l'effetto dannoso di un eccesso di ossigeno. La concentrazione ottimale di ossigeno per varie colture cellulari varia dal 9 al 17% o 293 mm Hg. pilastro. A concentrazioni di ossigeno superiori al 20%, la crescita cellulare è inibita. Pertanto, a una concentrazione di ossigeno del 24%, la moltiplicazione delle cellule renali embrionali di coniglio (linea ERK) è diminuita della metà e al 30% è stata ridotta a zero. Un aumento della concentrazione di ossigeno ha un effetto tossico sul metabolismo cellulare.

Pertanto, la riproduzione delle cellule in sospensione dipende dalla concentrazione delle cellule nella sospensione iniziale, dall'aerazione e dal pH del mezzo, dalla composizione del mezzo nutritivo, dal metodo di miscelazione, dal volume della sospensione e da altri fattori.

L'omogeneità della sospensione, la possibilità di mantenimento a lungo termine delle cellule nella fase logaritmica della crescita, le prospettive di modellazione matematica dei processi di crescita cellulare in funzione dell'influenza di fattori ambientali, la convenienza di molteplici studi sullo stato fisiologico del coltura cellulare in sospensione, l'elevata efficienza del metodo: questo non è un elenco completo dei vantaggi delle colture in sospensione.

Le colture in sospensione sono ampiamente utilizzate negli studi virologici e per l'accumulo di grandi quantità di materiale contenente virus, nella produzione di vaccini e preparati diagnostici.

3.5 Coltivazione di cellule su microcarrier

Nel 1967, Van Werel propose un metodo di coltura che combina elementi di crescita cellulare monostrato e sospensione, che chiamò metodo "microcarrier". La sua essenza sta nel fatto che le cellule si attaccano e si moltiplicano sulla superficie delle sfere-particelle polimeriche di "microcarrier" (MN), che sono contenute in sospensione mediante un dispositivo di miscelazione, come un agitatore. Su una particella MN con un diametro di 160–230 mm, possono adattarsi 350–630 (o una media di 460) celle. In un ml di terreno possono essere sospese diverse migliaia di particelle di microcarrier, con un'area totale compresa tra pochi e 50 cm 2 /ml.

Le cellule inoculate nel coltivatore si attaccano alla superficie delle particelle MN e si moltiplicano per formare un monostrato continuo su ogni singola particella.

I principali vantaggi di questo metodo sono:

1) creare condizioni uniformi in tutto il volume della nave, che consente di controllare efficacemente i parametri necessari (pH, p0 2, ecc.); 2) ottenere un'alta densità della popolazione cellulare fino a 5-6 milioni di cellule per 1 ml; 3) coltivazione simultanea di diverse centinaia di miliardi di cellule; 4) l'introduzione di un controllo costante sulla dinamica della crescita cellulare; 5) una diminuzione della crescita della contaminazione dovuta a una riduzione delle operazioni associate alla depressurizzazione del recipiente di coltura; 6) risparmi significativi nei mezzi nutritivi; 7) la capacità di mantenere le cellule cresciute direttamente sulle particelle a basse temperature; 8) la capacità di creare artificialmente varie concentrazioni di MN con cellule cresciute su di esse; 9) la possibilità di passare la coltura senza l'uso di tripsina aggiungendo porzioni fresche del microcarrier.

I microportatori devono avere:

Una piccola carica positiva nell'intervallo 1,5-1,8 MEKV / g. A causa del fatto che la maggior parte delle cellule animali ha una carica debolmente negativa, si legheranno più facilmente a un tale MN:

Densità 1,05--1,15 g/cm; la densità indicata è ottimale per mantenere in sospensione i MN;

Il diametro delle particelle va da 100 a 250 micron, che fornisce aree per la crescita di diverse centinaia di cellule;

Superficie liscia;

Trasparenza;

Mancanza di tossicità dei componenti per le cellule;

Leggero assorbimento di componenti medi;

Versatilità, fornendo la possibilità di utilizzarli per cellule primarie, diploidi ed eteroploidi. Di non poca importanza sono le proprietà di MH, che ne consentono un uso ripetuto.

È stato condotto uno studio su molte preparazioni granulari di varia natura chimica, tra cui quelle a base di destrano reticolato (PS), PS-agarosio, PS-polivinilpirrolidone, poliacrilnitrito, gel di silice poroso, polistirene, capron, nylon e alluminosilicato. per utilizzarli come microportatori.

Adatti sono solo alcuni di essi, principalmente a base di PS-destrano.

Diverse aziende straniere hanno sviluppato preparazioni commerciali pronte all'uso di microcarrier: Cytodex-1, 2, 3 (Francia, Svezia), Superbit (USA, Inghilterra), Biosilon (Danimarca). Il costo di questi farmaci è piuttosto elevato, quindi è necessario condurre ricerche sullo sviluppo e la produzione di MN domestici.

La coltura cellulare su microcarrier viene effettuata in fermentatori di colture in sospensione convenzionali. Il fermentatore non deve presentare sporgenze, sacche, per evitare l'accumulo di microportatori nelle zone stagnanti. Pertanto, è ragionevole utilizzare fermentatori con fondo tondo e pareti lisce. L'interno del fermentatore deve essere siliconato per evitare che i microvettori aderiscano al vetro o all'acciaio inossidabile del fermentatore.

L'attrezzatura standard può essere utilizzata per controllare le condizioni del raccolto come pH e O 2 . La velocità di miscelazione della sospensione con il vettore dovrebbe essere di 40-60 giri/min. Vari tipi di cellule vengono utilizzati per la coltivazione su MH.

La concentrazione di Cytodex può variare da 0,5 a 5 mg/ml. Tuttavia, nella produzione di vaccini profilattici, viene solitamente utilizzata una concentrazione finale di cytodex non superiore a 1 mg/ml. L'aumento della concentrazione a 3 mg/ml e oltre crea ulteriori difficoltà associate alla necessità di perfusione del mezzo nutritivo e alla sua sostituzione parziale, che complica il processo tecnologico.

La concentrazione dell'inoculo delle cellule, così come le condizioni di coltivazione su MN nelle prime ore, determinano in gran parte i parametri ottimali per la proliferazione e il massimo accumulo di cellule. È stato dimostrato che l'inoculazione di 10 cellule/ml di una linea continua di reni di scimmia (Vero) e di cellule diploidi di fibroblasti embrionali umani (MRC-5) in un volume medio ridotto a 1/3 e con l'agitatore acceso periodicamente (30 rpm) per un minuto dopo ogni ora per 4 ore, seguito dall'aggiunta del mezzo nutritivo al volume finale, porta ad un aumento della proliferazione cellulare e del loro numero rispetto al controllo (volume pieno del mezzo nutritivo al momento della messa a dimora delle celle e funzionamento continuo dell'agitatore dall'inizio della coltivazione).

Il mezzo nutritivo è importante per la coltura delle cellule su MN. Una corretta selezione del mezzo nutritivo aiuterà anche a ottimizzare il processo di proliferazione cellulare e la loro qualità. È necessario selezionare i terreni nutritivi per la coltura delle cellule su vari tipi di MN. È stato dimostrato che la linea cellulare trapiantata di reni di scimmia (Vero) su cytodex fornisce la resa più elevata quando si utilizza il terreno Eagle DME (concentrazione cellulare di impianto 10,5 ml) ma rispetto al terreno BME e 199. Se il numero di cellule durante l'impianto è ridotto a 10 4 , allora i migliori terreni danno risultati 199. Tutti i terreni testati contenevano il 10% di siero fetale.

3.6 Crescita di virus in colture cellulari

Colture primarie, ceppi cellulari e linee cellulari consolidate sono attualmente utilizzate per isolare e propagare virus animali. In termini generali, la procedura è la stessa per tutti i virus.

Il terreno viene rimosso dal monostrato cellulare e il monostrato viene lavato con soluzioni saline tamponate bilanciate (SBSR) o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere gli inibitori (anticorpi) che possono essere presenti nel terreno. Le particelle virali vengono sospese in una piccola quantità di SBSR o PBS e adsorbite dalle cellule entro 30-60 minuti. Le soluzioni saline vengono quindi sostituite con terreno fresco.

L'infezione di cellule coltivate con virus provoca cambiamenti morfologici caratteristici nelle cellule. I processi cellulari degenerativi finali (effetto citopatogeno, CPE) vengono rilevati solo dopo alcune settimane di crescita in presenza di virus, ma in alcuni casi i CPE vengono rilevati dopo 12 ore.I dettagli dei cambiamenti morfologici sono diversi nel caso di virus diversi.

Se, invece di un'infezione produttiva, il virus provoca la trasformazione cellulare, allora questo è anche accompagnato da cambiamenti caratteristici nella morfologia e nelle caratteristiche della crescita cellulare.

4. Precauzioni durante la manipolazione di cellule infette da virus

I virus hanno un effetto citopatogeno e fungono da agenti eziologici in molte malattie umane e animali. Inoltre, molti virus (p. es., oncornavirus, herpesvirus di tipo II, adenovirus, virus del polioma e SV40) sembrano essere agenti cancerogeni negli animali. A causa della capacità dei virus di passare attraverso i filtri batterici, può essere difficile escludere virus da colture cellulari non infette in presenza di sospensioni virali, dove è possibile la trasmissione del virus attraverso l'aria della stanza di coltura.

Le seguenti precauzioni sono di carattere generale e si applicano solo quando i virus non presentano alcun rischio particolare. Quando si utilizzano virus altamente pericolosi che rappresentano un pericolo per la salute del personale di laboratorio o delle persone e degli animali nel mondo circostante, è necessario adottare ulteriori precauzioni. I virus di particolare interesse includono virus della malattia di Newcastle, virus dell'afta epizootica, virus della stomatite vescicolare, virus del vaiolo, virus della rabbia, virus dell'herpes di tipo B e così via. Inoltre, non si può essere sicuri che anche virus come SV40 non rappresentino un pericolo per l'uomo.

È necessario utilizzare una stanza o un gruppo di stanze speciali per infettare le cellule e far crescere le cellule infette da virus.

Nessun virus vivo deve essere rimosso da queste stanze a meno che non sia contenuto in contenitori ermeticamente chiusi. Devono essere prese precauzioni per garantire che le superfici esterne di questi contenitori non siano contaminate da particelle virali.

Quando si lavora con i virus, è necessario utilizzare indumenti protettivi speciali (camici da laboratorio). Dopo il lavoro, questi indumenti devono essere collocati in un apposito serbatoio per la sterilizzazione in autoclave.

Tutti i supporti e la vetreria che sono stati in contatto con i virus devono essere trattati con cloro; solo dopo possono essere portati fuori dalla stanza progettata per funzionare con i virus.

Tutti gli utensili di plastica devono essere collocati in un apposito serbatoio per autoclave.

Le attrezzature per la conservazione e la manipolazione del materiale virale devono essere collocate all'interno della struttura di manipolazione del virus.

Il laboratorio dovrebbe essere dotato di autoclavi a due cicli in modo che il personale di laboratorio sia protetto da materiali nocivi.

4.1 Rilevamento virus

I virus possono essere rilevati e quantificati utilizzando una serie di test diversi, come:

1) L'attività virale viene misurata determinando la quantità di materiale contenente virus necessaria per suscitare una risposta specifica nell'ospite. La risposta indotta dal virus può essere tutto o niente (cioè la presenza o l'assenza di infezione), oppure può essere quantificata, come il tempo necessario per la comparsa di un'infezione o il numero di lesioni in una cellula suscettibile strato. La determinazione quantitativa dell'attività virale è chiamata titolazione.

La più piccola quantità di virus che può causare una reazione appropriata è chiamata unità infettiva e il titolo della sospensione virale iniziale è espresso come numero di unità infettive per unità di volume. Ad esempio, se la quantità minima di sospensione del virus dell'influenza che causa la polmonite in un topo quando viene iniettata per via intranasale una sospensione di tessuto polmonare infetto in una diluizione di 1:10 6 è 0,1 ml, ciò significa che il titolo del virus dell'influenza nel la sospensione iniziale del tessuto polmonare è di 10 7 unità infettive per 1 ml--1/(10~1-10-6)=10 7 .

Di norma, un componente obbligatorio del metodo di titolazione del virus è un test che consente di valutare il risultato dell'inoculazione come positivo o negativo. Ad esempio, durante la titolazione di virus animali, tale test può essere la presenza o l'assenza di lesioni visibili nella coltura cellulare, una reazione infiammatoria nel sito di inoculazione del virus nella pelle o nella cornea, la paralisi risultante dall'introduzione del virus in il cervello dell'animale, ecc. A volte la riproduzione del virus può essere rilevata anche in assenza di una reazione visibile da parte dell'organismo ospite: ad esempio, l'infezione di embrioni di pollo con mixovirus può essere rilevata dalla comparsa di emoagglutinine nell'allantoico fluido.

I migliori risultati si ottengono con metodi di titolazione, che si basano sul conteggio del numero di lesioni discrete in una determinata area di uno strato di cellule infettate con una quantità nota di materiale contenente virus. Nei casi in cui il numero di cellule sensibili e accessibili al virus può essere considerato praticamente infinitamente grande, come, ad esempio, quando una coltura monostrato di batteri su agar nutriente è infettata da un fago o quando una coltura continua monostrato di cellule animali è infettata da un virus, le lesioni causate dal virus o le placche formate dai fagi, in questo senso, sono simili alle colonie batteriche su un denso mezzo nutritivo. Così come il numero di queste colonie è proporzionale al numero di cellule batteriche contenute nel preparato titolabile, così il numero di placche è direttamente proporzionale alla quantità di virus aggiunto alla coltura monostrato, la formazione di particelle virali da parte delle cellule infette, che possono essere identificati, ad esempio, dalla natura degli acidi nucleici e dalla simmetria delle particelle.

2) La produzione di acidi nucleici da parte di cellule infette, che possono avere una densità caratteristica mediante centrifugazione in gradiente di densità o una dimensione caratteristica mediante elettroforesi su gel di agarosio o centrifugazione in gradiente di concentrazione di saccarosio.

3) Formazione da parte di cellule infette o cellule trasformate di antigeni caratteristici, che possono essere visualizzati mediante colorazione con anticorpi specifici fluorescenti o causare cambiamenti nella membrana cellulare che portano all'adsorbimento dell'eme. Nel metodo diretto, gli anticorpi generati contro gli antigeni virali vengono combinati con un fluorocromo e utilizzati per colorare le cellule infette. Una reazione positiva (giallo-verde al microscopio a fluorescenza) indica la presenza di antigeni virali nelle cellule. Questo metodo può quindi essere utilizzato per rilevare la trasformazione cellulare quando vengono generati anticorpi contro, ad esempio, antigeni precoci del virus SV40, o per rilevare la formazione di virus maturi quando vengono generati anticorpi contro le proteine ​​del capside. Nel metodo indiretto, gli anticorpi non sono combinati con un fluorocromo. Invece, dopo l'interazione degli anticorpi con gli antigeni nelle preparazioni cellulari fisse, vengono aggiunti ad essi anticorpi anti-gammaglobulina coniugati con fluorocromo. Questo metodo è più sensibile ed evita la coniugazione di ogni singolo anticorpo con un colorante fluorescente. Pertanto, gli stessi anticorpi fluorescenti per gli anticorpi di coniglio (ottenuti nelle pecore contro le gammaglobuline di coniglio) possono essere usati per colorare qualsiasi anticorpo prodotto nei conigli e che interagisce con antigeni virali in cellule infettate o trasformate in modo produttivo. Un metodo ancora più indiretto, ma molto più sensibile che non richiede l'uso di un microscopio a fluorescenza è il metodo perossidasi-antiperossidasi. Secondo questo metodo, gli anticorpi di coniglio interagiscono con antigeni cellulari fissi e vengono quindi rivestiti con anticorpi di capra contro immunoglobuline di coniglio coniugate con complessi di perossidasi di rafano e antiperossidasi di coniglio. Successivamente, i preparati vengono trattati con diammino-benzidina e perossido di idrogeno; il colore marrone indica la presenza di antigeni.

4) La presenza di antigeni sulle particelle virali può portare a reazioni di emoagglutinazione, consentendo una valutazione quantitativa. Molti virus hanno antigeni che possono essere adsorbiti sui globuli rossi e farli aderire tra loro. Quando un gran numero di particelle virali ed eritrociti interagiscono, si forma una rete di cellule e la sospensione si agglutina, cioè precipitano gli eritrociti. C'è una certa specificità in quanto alcuni virus causano l'agglutinazione degli eritrociti di alcuni animali, ma se viene trovata una combinazione attiva, l'emoagglutinazione diventa un test rapido per determinare il titolo del virus. Il sangue viene aspirato in una siringa eparinizzata e gli eritrociti vengono lavati tre volte con riprecipitazione in NaCl allo 0,85% a 200 g per 10 min. Il sedimento eritrocitario finale viene sospeso in un volume di 200 volte di soluzione di NaCl allo 0,85%. Il modo più conveniente per testare l'emoagglutinazione è nelle piastre di microtitolazione. In una serie di pozzetti della piastra di microtitolazione, aggiungere 25 ml di 0,85% NaCl o PBS; 25 μl di sospensione virale vengono aggiunti al primo pozzetto e la miscela viene agitata (diluizione 1:2). 25 µl vengono quindi trasferiti dal primo pozzetto al secondo (diluizione 1:4) e così via, fino a quando la diluizione finale è 1:2048. Successivamente si aggiungono 25 µl di sospensione di eritrociti in ciascun pozzetto, si agita e si lascia a 4°C, temperatura ambiente o 37°C fino a che non si verifica l'emoagglutinazione (1-2 ore). Nei pozzetti in cui si è verificata l'agglutinazione, il sedimento eritrocitario ha una forma irregolare e nei pozzetti in cui non si è verificata l'emoagglutinazione, il sedimento cellulare forma un punto compatto sul fondo del pozzetto. La diluizione nell'ultimo pozzetto in cui si è verificata l'emoagglutinazione è considerata il titolo, ea questa diluizione è assegnato il valore di 1 unità di emoagglutinazione (HAU). La diluizione precedente contiene rispettivamente 2 HAU e così via.

5) La formazione da parte delle cellule infette di enzimi caratteristici, o enzimi facilmente distinguibili per le loro proprietà dai corrispondenti enzimi delle cellule ospiti.

4.2 Coltivazione di picornavirus utilizzando l'esempio dell'ottenimento di poliovirus di tipo 3 nella coltura cellulare HeLa

Come tecnica specifica per la coltura dei virus, si può citare un metodo per far crescere il poliovirus in cellule continue.

Tutte le procedure sono eseguite in condizioni sterili.

Alcune sottolinee di cellule HeLa (ad es. HeLa S3) possono crescere in terreni a basso contenuto di ioni di calcio (ad es. CaS2MEM). Per un'infezione efficace, è essenziale che le cellule crescano bene in una sospensione omogenea. Le cellule vengono pellettizzate mediante centrifugazione a bassa velocità (15 min a 900 g) e risospese in CaS2MEM a una concentrazione di ~ 2. 10 7 cellule/ml (~1/20 del volume originale).

Il virus viene aggiunto alla sospensione cellulare ad una concentrazione di 10-50 PFU per cellula; incubare su agitatore magnetico per 1 ora a 35°C.

La sospensione viene diluita con lo stesso mezzo ad una concentrazione di 2. 10 6 cellule/ml e aggiungere 100 μCi di [ 3 H]-uridina.

La sospensione cellulare viene incubata per 8 h, dopo di che le cellule vengono pellettate mediante centrifugazione a bassa velocità (15 min a 900 g) e lavate una volta con soluzione tampone fosfato (PBS) priva di ioni magnesio e calcio.

Le cellule vengono risospese in PBS (5-10 7 cellule/ml) e sottoposte a tre cicli di congelamento-scongelamento.

I detriti cellulari vengono rimossi mediante centrifugazione.

Il surnatante viene conservato per un'ulteriore purificazione.

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Colture cellulari di mammiferi

Le colture di cellule di mammiferi sono state uno dei principali strumenti utilizzati dagli specialisti dell'allevamento del bestiame per più di un decennio. In condizioni di laboratorio, le uova ottenute da vacche di qualità eccezionale vengono fecondate con gli spermatozoi dei rispettivi tori. Gli embrioni risultanti vengono coltivati ​​in una provetta per diversi giorni, dopodiché vengono impiantati nell'utero di vacche madri surrogate. La stessa tecnica è alla base della fecondazione umana in vitro.

Attualmente, l'uso di colture cellulari di mammiferi va ben oltre l'inseminazione artificiale. Le cellule dei mammiferi possono integrare, e forse un giorno sostituire, l'uso di animali per testare la sicurezza e l'efficacia di nuovi farmaci. Inoltre, proprio come le cellule delle piante e degli insetti, le cellule dei mammiferi possono essere utilizzate per sintetizzare farmaci, in particolare alcune proteine ​​animali che sono troppo complesse per essere sintetizzate da microrganismi geneticamente modificati. Ad esempio, gli anticorpi monoclonali sono sintetizzati da colture di cellule di mammifero.

Gli scienziati stanno anche valutando l'utilizzo di cellule di mammifero per produrre vaccini. Nel 2005, il Dipartimento della salute e dei servizi umani degli Stati Uniti ha assegnato a Sanofi Pasteur un contratto da 97 milioni di dollari. Il compito degli specialisti dell'azienda è sviluppare metodi per coltivare cellule di mammiferi al fine di accelerare lo sviluppo di vaccini antinfluenzali e, di conseguenza, aumentare la preparazione dell'umanità a una pandemia.

Terapie basate sulla cultura cellule staminali adulte presenti in alcuni tessuti del corpo (midollo osseo, tessuto adiposo, cervello, ecc.) prenderanno presto il loro giusto posto nella pratica clinica. I ricercatori hanno scoperto che le cellule staminali possono essere utilizzate dal corpo per riparare i tessuti danneggiati. Le cellule staminali ematopoietiche adulte sono state a lungo utilizzate come trapianti di midollo osseo. Sono necessari per ripristinare i processi di maturazione e formazione di tutti i tipi di cellule del sangue. Tali cellule possono essere ottenute in grandi quantità dal sangue cordonale, ma il loro isolamento è un processo piuttosto complicato.

I ricercatori stanno attualmente lavorando su metodi per isolare le cellule staminali dalla placenta e dal tessuto adiposo. Numerosi specialisti sono impegnati nello sviluppo di metodi per la riprogrammazione cellulare, riportando le cellule mature del corpo, ad esempio le cellule della pelle, a uno stato indifferenziato e la successiva stimolazione della loro differenziazione in cellule del tipo di tessuto richiesto.

Cellule staminali embrionali

Utilizzo cellule staminali embrionaliè anche considerato un potenziale metodo di terapia per molte malattie. Come suggerisce il nome, le cellule fetali sono ottenute da embrioni, in particolare quelle che si sviluppano da uova, fecondate in vitro (cliniche di fecondazione in vitro) e, con il consenso dei donatori, donate a ricercatori per uso scientifico. Di solito vengono utilizzate le blastocisti: embrioni di 4-5 giorni che sembrano palline al microscopio, costituiti da diverse centinaia di cellule.

Per l'isolamento delle cellule staminali embrionali umane, la massa cellulare interna della blastocisti viene trasferita in un terreno di coltura ricco di sostanze nutritive, dove le cellule iniziano a dividersi attivamente. Entro pochi giorni, le cellule coprono l'intera superficie della piastra di coltura. Successivamente, i ricercatori raccolgono le cellule in divisione, le dividono in parti e le posizionano in nuove piastre. Viene chiamato il processo di spostamento delle cellule in nuove piastre risemina e può essere ripetuto molte volte per molti mesi. Il ciclo di passaggio cellulare è chiamato passaggio. Le cellule staminali embrionali che sono esistite in coltura per sei o più mesi senza differenziazione (cioè, rimanendo pluripotenti - in grado di differenziarsi in cellule di qualsiasi tessuto del corpo) e conservando un normale set di geni sono chiamate linea di cellule staminali embrionali.

La superficie interna della piastra di coltura è spesso ricoperta di cellule della pelle di embrioni di topo geneticamente modificati per non riuscire a dividersi. Queste cellule formano uno strato di alimentazione - un "substrato nutritivo", grazie al quale le cellule embrionali sono attaccate alla superficie. Gli scienziati stanno cercando di migliorare il metodo esistente ed eliminare la necessità di utilizzare cellule di topo, poiché la loro presenza introduce sempre il rischio che particelle virali e proteine ​​​​di topo entrino nella coltura di cellule umane che possono causare una reazione allergica.

Il valore massimo della terapia con cellule staminali e dell'ingegneria tissutale può essere raggiunto se le cellule staminali terapeutiche ei tessuti cresciuti da esse sono geneticamente identici alle cellule del ricevente. Pertanto, se il paziente stesso non è la loro fonte, le cellule staminali devono essere modificate sostituendo il loro materiale genetico con i geni del ricevente e solo successivamente differenziate in cellule di un tipo specifico. Attualmente, la procedura per la sostituzione del materiale genetico e la riprogrammazione può essere eseguita con successo solo con cellule staminali embrionali.

Metodi di coltivazione del virus.

Per la coltivazione di virus vengono utilizzate colture cellulari, embrioni di pollo e animali da laboratorio sensibili. Gli stessi metodi sono utilizzati anche per la coltivazione di rickettsia e clamidia, batteri intracellulari obbligati che non crescono su terreni nutritivi artificiali.

Colture cellulari. Le colture cellulari sono preparate da tessuti animali o umani. Le colture sono divise in primarie (non trapiantabili), semi-trapiantabili e trapiantabili.

Preparazione della coltura cellulare primaria consiste in diverse fasi successive: macinazione del tessuto, separazione delle cellule mediante tripsinizzazione, lavaggio della risultante sospensione omogenea di cellule isolate dalla tripsina, seguita dalla sospensione delle cellule in un mezzo nutritivo che ne assicuri la crescita, ad esempio, nel mezzo 199 con l'aggiunta di siero di sangue di vitello.

Colture trapiantate a differenza di quelli primari, sono adattati a condizioni che assicurano la loro esistenza permanente in vitro e persistono per diverse decine di passaggi.

Le colture cellulari continue a strato singolo vengono preparate da linee cellulari maligne e normali che hanno la capacità di moltiplicarsi in vitro per lungo tempo in determinate condizioni. Questi includono cellule HeLa maligne originariamente isolate dal carcinoma cervicale, Hep-3 (dal carcinoma linfoide), nonché normali cellule amniotiche umane, reni di scimmia, ecc.

Alle colture semiperenni sono cellule diploidi umane. Rappresentano un sistema cellulare che conserva durante 50 passaggi (fino a un anno) un corredo diploide di cromosomi, tipico delle cellule somatiche del tessuto utilizzato. Le cellule umane diploidi non subiscono trasformazione maligna e questo si confronta favorevolmente con le cellule tumorali.

Informazioni sulla riproduzione (riproduzione) di virus nella coltura cellulare giudicato dall'effetto citopatico (CPE), che può essere rilevato al microscopio ed è caratterizzato da cambiamenti morfologici nelle cellule.

La natura del CPD dei virus viene utilizzata sia per il loro rilevamento (indicazione) che per l'identificazione provvisoria, ovvero per determinarne la specie.

Uno dei metodi L'indicazione dei virus si basa sulla capacità della superficie delle cellule in cui si riproducono di adsorbire gli eritrociti - la reazione di emoassorbimento. Per metterlo in una coltura di cellule infette da virus, viene aggiunta una sospensione di eritrociti e, dopo un certo tempo di contatto, le cellule vengono lavate con una soluzione isotonica di cloruro di sodio. Gli eritrociti aderenti rimangono sulla superficie delle cellule colpite dal virus.

Un altro metodo è la reazione di emoagglutinazione (RG). Viene utilizzato per rilevare i virus nel fluido di coltura della coltura cellulare o nel liquido corionallantoico o amniotico di un embrione di pollo.

Il numero di particelle virali è determinato mediante titolazione mediante CPE nella coltura cellulare. Per fare ciò, le cellule di coltura vengono infettate con una diluizione dieci volte del virus. Dopo 6-7 giorni di incubazione, vengono esaminati per la presenza di CPP. La più alta diluizione che causa CPE nel 50% delle colture infette viene presa come titolo del virus. Il titolo del virus è espresso come numero di dosi citopatiche.

Un metodo quantitativo più accurato per tenere conto delle singole particelle virali è il metodo della placca..

Alcuni virus possono essere rilevati e identificati da inclusioni che si formano nel nucleo o nel citoplasma delle cellule infette.

Embrioni di pollo. Gli embrioni di pollo, rispetto alle colture cellulari, hanno molte meno probabilità di essere contaminati da virus e micoplasmi e hanno anche una vitalità e resistenza relativamente elevate a varie influenze.

Per ottenere colture pure di rickettsia, clamidia e numerosi virus a scopo diagnostico, nonché per la preparazione di vari preparati (vaccini, diagnostici), vengono utilizzati embrioni di pollo di 8-12 giorni. La riproduzione dei microrganismi menzionati è giudicata dai cambiamenti morfologici rilevati dopo l'apertura dell'embrione sulle sue membrane.

La riproduzione di alcuni virus, come l'influenza, il vaiolo, può essere giudicata dalla reazione di emoagglutinazione (RHA) con pollo o altri eritrociti.

Gli svantaggi di questo metodo includono l'impossibilità di rilevare il microrganismo studiato senza prima aprire l'embrione, nonché la presenza di una grande quantità di proteine ​​​​e altri composti in esso, che ostacolano la successiva purificazione di rickettsiae o virus nella produzione di vari preparazioni.

animali da laboratorio. La sensibilità delle specie degli animali a un particolare virus e la loro età determinano la capacità riproduttiva dei virus. In molti casi, solo gli animali appena nati sono sensibili a un particolare virus (ad esempio, i topi lattanti sono sensibili ai virus Coxsackie).

Il vantaggio di questo metodo rispetto ad altri è la possibilità di isolare quei virus scarsamente riprodotti in coltura o nell'embrione. I suoi svantaggi includono la contaminazione del corpo di animali da esperimento con virus e micoplasmi estranei, nonché la necessità di una successiva infezione della coltura cellulare per ottenere una linea pura di questo virus, che allunga il tempo di studio.

INTRODUZIONE

Per l'accumulo quantitativo di virus, le colture cellulari sono il sistema più conveniente. I primi tentativi di coltivare cellule animali al di fuori del corpo risalgono alla fine del secolo scorso. Queste osservazioni frammentarie indicavano la possibilità di preservare la vitalità di tessuti e cellule in condizioni artificiali e segnarono l'inizio di una profonda ricerca scientifica sulle colture di tessuti.

Un grande merito nello sviluppo di metodi per coltivare i tessuti spetta a Carrel, che fu il primo a dimostrare la possibilità di riproduzione di cellule animali in condizioni artificiali, dimostrando così la loro "immortalità" e somiglianza con organismi unicellulari a vita libera. Progressi significativi in ​​questa direzione sono stati compiuti da un gruppo di ricercatori guidati da Earl. Sono stati i primi ad ottenere la crescita di un gran numero di cellule su vetro e in sospensione liquida agitata. L'avvento degli antibiotici e i progressi nei mezzi di coltura artificiali hanno inaugurato una nuova era nello sviluppo delle tecniche di coltura dei tessuti.

Le colture di tessuti sono state a lungo utilizzate per risolvere vari problemi in biologia e medicina. Tuttavia, solo i successi nel campo della virologia raggiunti con l'aiuto delle colture di tessuti sono stati un potente stimolo per il loro sviluppo fino al livello attuale.

La coltivazione di virus aiuta a risolvere una serie di problemi teorici associati allo studio delle caratteristiche dell'interazione "virus-cellula". Inoltre, la soluzione di una serie di problemi applicati relativi alla diagnosi e alla produzione di farmaci per la prevenzione delle infezioni virali è impossibile senza l'accumulo di materie prime contenenti virus.

1. Tipi di colture cellulari.

Il trasferimento delle cellule di un intero organismo alle condizioni di vita in vitro cessa la loro esistenza come uno dei numerosi elementi strutturali del tessuto o dell'organo in cui erano precedentemente incluse. Allo stesso tempo, le cellule sfuggono al controllo dei fattori neuroumorali e acquisiscono una serie di caratteristiche che dipendono sia dal fatto stesso del rigetto cellulare da questi tessuti sia dalle condizioni specifiche della loro esistenza in vitro.

Le cellule oi tessuti che vivono al di fuori del corpo sono caratterizzati da un intero complesso di caratteristiche metaboliche, morfologiche e genetiche che sono nettamente diverse dalle proprietà delle cellule di organi e tessuti in vivo.

Diversi tipi di tessuti e colture cellulari sopravvissuti e in crescita si distinguono a seconda del metodo di espianto primario del tessuto e della tecnica della sua coltivazione. Le colture a strato singolo e in sospensione di cellule in crescita sono le più utilizzate. Costituiscono la base della moderna pratica virologica di laboratorio e industriale.

Esistono due tipi principali di colture cellulari a strato singolo: primarie e trapiantate.

Il termine "primario" si riferisce a una coltura cellulare ottenuta direttamente da tessuti umani o animali nel periodo embrionale o postnatale. La durata della vita di tali colture è limitata. Dopo un certo tempo compaiono in esse fenomeni di degenerazione aspecifica, che si esprime in granulazione e vacuolizzazione del citoplasma, arrotondamento delle cellule, perdita di comunicazione tra le cellule e il substrato solido su cui sono cresciute. Il cambio periodico del mezzo, i cambiamenti nella composizione di quest'ultimo e altre procedure possono aumentare solo leggermente la durata della coltura cellulare primaria, ma non possono impedirne la distruzione e la morte finali. Con ogni probabilità, questo processo è associato alla naturale estinzione dell'attività metabolica delle cellule che sono fuori controllo dei fattori neuroumorali che agiscono nell'intero organismo.

Solo singole cellule o gruppi di cellule nella popolazione sullo sfondo della degenerazione della maggior parte dello strato cellulare possono mantenere la capacità di crescere e riprodursi. Queste cellule, avendo trovato la potenza della riproduzione infinita in vitro, danno origine a colture cellulari trapiantate dopo ripetute inoculazioni.

Ci sono linee e ceppi di cellule trapiantate. Il primo termine si riferisce a cellule trapiantabili caratterizzate da potenziale immortalità e, di regola, un cariotipo eteroploide; il secondo termine si riferisce a cellule semi-trapiantabili con un corredo diploide di cromosomi e una durata di vita limitata in vitro. La comparsa sia di queste che di altre cellule è associata al processo di selezione nella popolazione cellulare delle colture primarie, che sono quindi la fonte di tutte le linee e ceppi di cellule trapiantate.

Il vantaggio principale delle linee cellulari trapiantabili, rispetto a qualsiasi coltura primaria, è il potenziale di riproduzione illimitata al di fuori del corpo e la relativa autonomia che le avvicina ai batteri e ai protozoi unicellulari.

La capacità delle cellule trapiantate di riprodursi all'infinito in vitro segna un salto qualitativo, a seguito del quale le cellule acquisiscono la capacità di un'esistenza autonoma, simile ai microrganismi cresciuti su mezzi nutritivi artificiali. La totalità dei cambiamenti che portano alla comparsa di tali caratteristiche nelle cellule è chiamata trasformazione e le cellule delle colture di tessuti trapiantate sono chiamate trasformate.

I miglioramenti nelle tecniche di coltura cellulare hanno notevolmente ampliato le possibilità di ottenere linee cellulari trapiantabili da un'ampia varietà di tessuti animali e umani. Allo stesso tempo, non è stato trovato alcun limite di età, oltre il quale i tessuti perderebbero la capacità di adattarsi a una crescita illimitata in vitro, cioè. alla trasformazione.

Un'altra fonte di linee cellulari trapiantate sono le neoplasie maligne. In questo caso, la trasformazione cellulare avviene in vivo come risultato dello sviluppo di un processo patologico, la cui eziologia rimane in gran parte poco chiara.

Non tutte le neoplasie maligne sono in grado di dare origine a colture cellulari trapiantabili. Quindi, ad esempio, sono stati fatti tentativi infruttuosi di ottenere cellule trapiantabili da tumori cancerosi dello stomaco umano e delle ghiandole mammarie. È difficile adattare alla vita in vitro le cellule del carcinoma a cellule squamose della pelle e delle mucose. D'altra parte, le linee sono relativamente facilmente derivate dai tessuti dei sarcomi e dei tumori maligni del sistema nervoso.

1966).

Le tecniche di coltura cellulare si sono sviluppate in modo significativo negli anni '40 e '50 in connessione con la ricerca nel campo della virologia. La coltivazione di virus in colture cellulari ha permesso di ottenere materiale virale puro per la produzione di vaccini. Il vaccino antipolio è stato uno dei primi farmaci ad essere prodotto in serie utilizzando la tecnologia della coltura cellulare. Nel 1954, Enders, Weller e Robbins ricevettero il Premio Nobel "per la loro scoperta della capacità del virus della poliomielite di crescere in colture di vari tessuti". Nel 1952 fu sviluppata la ben nota linea cellulare di cancro umano HeLa.

Principi base della coltivazione

Isolamento cellulare

Per la coltivazione al di fuori del corpo, le cellule viventi possono essere ottenute in diversi modi. Le cellule possono essere isolate dal sangue, ma solo i leucociti possono crescere in coltura. Le cellule mononucleate possono essere isolate dai tessuti molli utilizzando enzimi come la collagenasi, la tripsina e la pronasi che degradano la matrice extracellulare. Inoltre, pezzi di tessuti e materiali possono essere inseriti nel mezzo nutritivo.

Le colture di cellule prelevate direttamente dall'oggetto (ex vivo) sono dette primarie. La maggior parte delle cellule primarie, ad eccezione delle cellule tumorali, ha una durata di vita limitata. Dopo un certo numero di divisioni cellulari, tali cellule invecchiano e smettono di dividersi, sebbene possano ancora rimanere vitali.

Esistono linee cellulari immortalizzate ("immortali") che possono moltiplicarsi all'infinito. Nella maggior parte delle cellule tumorali questa capacità è il risultato di una mutazione casuale, ma in alcune linee cellulari di laboratorio viene acquisita artificialmente, attivando il gene della telomerasi.

Coltura cellulare

Le cellule vengono coltivate in speciali mezzi nutritivi a temperatura costante. L'illuminazione variabile viene utilizzata per le colture di cellule vegetali, mentre le cellule di mammiferi di solito richiedono anche un'atmosfera speciale mantenuta in un incubatore di colture cellulari. Di norma, la concentrazione di anidride carbonica e vapore acqueo nell'aria è regolata, ma a volte anche di ossigeno. I mezzi nutritivi per diverse colture cellulari differiscono per composizione, concentrazione di glucosio, composizione dei fattori di crescita, ecc. I fattori di crescita utilizzati nei terreni di coltura cellulare dei mammiferi sono più comunemente aggiunti insieme al siero del sangue. Uno dei fattori di rischio in questo caso è la possibilità di infezione della coltura cellulare con prioni o virus. Nella coltivazione, uno dei compiti importanti è evitare o ridurre al minimo l'uso di ingredienti contaminati. Tuttavia, in pratica, questo non è sempre raggiunto. Il modo migliore, ma anche il più costoso, è integrare con fattori di crescita purificati anziché con siero.

Contaminazione incrociata di linee cellulari

Quando si lavora con colture cellulari, gli scienziati possono affrontare il problema della contaminazione incrociata.

Caratteristiche delle cellule in crescita

Quando le cellule crescono, a causa della divisione costante, può verificarsi la loro sovrabbondanza nella coltura e, di conseguenza, sorgono i seguenti problemi:

• Accumulo nel mezzo nutritivo di prodotti di escrezione, compresi quelli tossici.
• Accumulo nella coltura di cellule morte che hanno cessato la loro attività vitale.
• L'accumulo di un gran numero di cellule ha un effetto negativo sul ciclo cellulare, la crescita e la divisione rallentano e le cellule iniziano a invecchiare e morire (inibizione della crescita da contatto).
• Per lo stesso motivo, può iniziare la differenziazione cellulare.

Per mantenere il normale funzionamento delle colture cellulari, nonché per prevenire fenomeni negativi, il mezzo nutritivo viene periodicamente sostituito, le cellule vengono trasferite e trasfettate. Per evitare la contaminazione delle colture con batteri, lieviti o altre linee cellulari, tutte le manipolazioni vengono solitamente eseguite in condizioni asettiche in una scatola sterile. Antibiotici (penicillina, streptomicina) e antimicotici (amfotericina B) possono essere aggiunti al terreno di coltura per sopprimere la microflora.

La coltivazione di cellule umane è in qualche modo contro le regole della bioetica, poiché le cellule coltivate in isolamento possono sopravvivere all'organismo genitore e quindi essere utilizzate per condurre esperimenti o sviluppare nuovi trattamenti e trarne profitto. La prima sentenza in questo ambito è stata emessa dalla Corte Suprema della California nel caso John Moore v. University of California, in base al quale i pazienti non hanno alcuna proprietà di linee cellulari derivate da organi prelevati con il loro consenso.

ibridoma

Uso di colture cellulari

La coltura cellulare di massa è la base per la produzione industriale di vaccini virali e una varietà di prodotti biotecnologici.

Prodotti biotecnologici

Un metodo industriale da colture cellulari produce prodotti come enzimi, ormoni sintetici, anticorpi monoclonali, interleuchine, linfochine, farmaci antitumorali. Sebbene molte proteine ​​semplici possano essere ottenute in modo relativamente semplice utilizzando rDNA in colture batteriche, proteine ​​più complesse come le glicoproteine ​​attualmente possono essere ottenute solo da cellule animali. Una di queste importanti proteine ​​è l'ormone eritropoietina. Il costo della coltivazione di colture di cellule di mammiferi è piuttosto elevato, quindi sono attualmente in corso ricerche sulla possibilità di produrre proteine ​​​​complesse in colture di cellule di insetti o piante superiori.

colture di tessuti

La coltura cellulare è parte integrante della tecnologia di coltura dei tessuti e dell'ingegneria dei tessuti, poiché definisce la base per la crescita delle cellule e il loro mantenimento in uno stato vitale ex vivo.

Vaccini

Utilizzando tecniche di coltura cellulare, vengono attualmente prodotti vaccini contro la poliomielite, il morbillo, la parotite, la rosolia e la varicella. A causa della minaccia di una pandemia influenzale causata dal ceppo H5N1 del virus, il governo degli Stati Uniti sta attualmente finanziando la ricerca su un vaccino contro l'influenza aviaria utilizzando colture cellulari.

Colture cellulari non di mammifero

Colture di cellule vegetali

Le colture di cellule vegetali vengono solitamente coltivate come sospensione in un mezzo nutritivo liquido o come coltura di calli su una base nutritiva solida. La coltivazione di cellule e calli indifferenziati richiede il mantenimento di un certo equilibrio di ormoni della crescita delle piante auxine e citochinine.

Colture batteriche e di lievito

Articolo principale: coltura batterica

Per la coltivazione di un piccolo numero di cellule batteriche e di lievito, le cellule vengono piastrate su un terreno nutriente solido a base di gelatina o agar-agar. Per la produzione di massa viene utilizzata la coltivazione in mezzi nutritivi liquidi (brodi).

colture virali