Diagnosi moderna di sifilide e valutazione dei risultati. Pnga-reazione di emoagglutinazione passiva. Indicatori di reazioni sierologiche - come criterio per il recupero

La sierodiagnosi viene utilizzata per confermare la diagnosi clinica di sifilide, fare una diagnosi di sifilide latente, monitorare l'efficacia del trattamento, come uno dei criteri per la cura dei pazienti con sifilide e per la prevenzione della sifilide (esame di alcuni gruppi di popolazione) . Le reazioni sierologiche consentono di rilevare i cambiamenti immunitari nel corpo del paziente in risposta alla riproduzione dell'agente patogeno in esso.

Struttura antigenica del treponema pallido. Gli antigeni più studiati sono:

1) antigeni proteici del treponema pallido; hanno nella loro composizione una frazione comune al treponema patogeno e al treponema saprofitico, contro i quali vengono sintetizzati gli anticorpi di gruppo; inoltre esiste una frazione specifica solo per i treponemi patogeni; gli antigeni proteici del treponema pallido sono altamente immunogenici, gli anticorpi contro di essi compaiono nel corpo alla fine del periodo di incubazione o durante la prima settimana dopo la comparsa di hard chancre;

2) antigeni di natura polisaccaridica; poco immunogenico, poiché gli anticorpi contro di loro non raggiungono titoli significativi, quindi il ruolo di questi anticorpi nella sierodiagnosi della sifilide è insignificante;

3) antigeni lipidici del treponema pallido; costituiscono circa il 30% della massa secca della cellula; oltre ai lipidi del treponema pallido, una grande quantità di sostanze di natura lipidica compaiono nel corpo del paziente a seguito della distruzione delle cellule dei tessuti, principalmente lipidi delle membrane mitocondriali; apparentemente hanno la stessa struttura degli antigeni lipidici del treponema pallido e hanno le proprietà degli autoantigeni; gli anticorpi nel corpo del paziente compaiono circa 5-6 settimane dopo l'infezione.

Alla risposta immunitaria dell'organismo partecipano sia meccanismi cellulari (macrofagi, linfociti T) che umorali (sintesi di immunoglobuline specifiche). La comparsa di anticorpi antisifilitici avviene secondo gli schemi generali della risposta immunitaria: dapprima vengono prodotte IgM, mentre la malattia si sviluppa, la sintesi di IgG inizia a predominare; Le IgA sono prodotte in quantità relativamente piccole.

La questione della sintesi di IgE e IgD non è attualmente ben compresa. Le IgM compaiono 2-4 settimane dopo l'infezione e scompaiono nei pazienti non trattati dopo circa 18 mesi; nel trattamento della sifilide precoce - dopo 3-6 mesi, in ritardo - dopo 1 anno. Le IgG di solito compaiono alla 4a settimana dopo l'infezione e di solito raggiungono titoli più alti delle IgM. Gli anticorpi di questa classe possono persistere a lungo anche dopo la guarigione clinica del paziente.

Gli anticorpi sifilitici possono essere non specifici (reagini) e specifici (antitreponemici). Le reagine sono dirette contro gli antigeni lipidici del treponema pallidum e contro gli autoantigeni derivanti dalla distruzione delle cellule del corpo. Va tenuto presente che le reagine si trovano anche nei tessuti normali e il loro numero aumenta in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Queste reazioni possono essere la causa delle cosiddette reazioni sierologiche false positive per la sifilide.

Anticorpi antitreponemici specifici correlati a IgM e IgG sono diretti contro il treponema pallidum e, come gli antigeni del treponema, possono essere gruppo-specifici e specie-specifici.

Per determinare gli anticorpi nel siero del sangue del paziente, vengono utilizzati vari test sierologici, che differiscono l'uno dall'altro per sensibilità, specificità, complessità della formulazione e costo. Dato che tutte le reazioni sierologiche alla sifilide in determinate condizioni possono essere false positive, dovrebbero essere messe in un complesso e, se necessario, in dinamica.

Le reazioni sierologiche, a seconda degli anticorpi che rilevano, sono divise in tre gruppi:

I. Reazioni lipidiche (reagine):

1) microreazioni su vetro con antigeni lipidici - un metodo diagnostico espresso (microreazioni di precipitazione - MRP, VDRL, CMF, RPR, ecc.);

2) reazione di fissazione del complemento (RSK) con antigeni lipidici - reazione di Wasserman;

3) reazioni sedimentarie (reazione di precipitazione di Kahn, reazione citocolica di Sachs-Vitebsky, ecc.).

II. Reazioni treponemiche di gruppo:

1) CSC con antigene proteico di Reiter;

2) reazione di immunofluorescenza (RIF);

3) reazione di adesione immunitaria (RIP).

III. Reazioni treponemiche proteiche specie-specifiche:

1) reazione di immobilizzazione di treponema pallido (RIT);

2) RIF Abs e sue varianti (IgM FTA ABS, 19S IgM FTA ABS, ecc.);

3) reazione di emoagglutinazione indiretta di treponemi pallidi (TPHA).

Diversi test sierologici vengono utilizzati per diversi scopi pratici. All'estero, durante le indagini di massa sulla popolazione e, se necessario, il rilevamento di emergenza della sifilide, vengono utilizzate le reazioni di screening (VDRL, ecc.). Per la diagnosi (conferma) della sifilide vengono utilizzati RSK con antigeni cardiolipina e trepone e RIF Abs. Per monitorare l'efficacia della terapia, si raccomanda VDRL quantitativo, 19S IgM FTA ABS e RIT viene utilizzato come reazione all'esame in caso di discrepanze nelle reazioni treponemiche. Se i risultati di RIT e 19S IgM FTA ABS sono negativi, si considera che il soggetto non soffre di sifilide.

Nella pratica domestica viene utilizzato un complesso di reazioni sierologiche, tra cui:

1) reazioni selettive di microprecipitazione (MRP) con antigene cardiolipina;

2) test sierologici standard - RSK con cardiolipina e antigeni treponemici;

3) RIF e sua modifica RIF Abs.;

Screening delle reazioni sierologiche per la sifilide o delle microreazioni su vetro per espresso? nasi

Queste reazioni sono utilizzate per esami sierologici di massa per la sifilide (persone di professioni decretate, pazienti in ospedali somatici, pazienti in policlinici e ambulatori); per la diagnostica rapida nei dispensari cutanei e venerei. Non vengono utilizzati per l'esame di donne in gravidanza e donatori, nonché per il controllo dopo il trattamento di pazienti con sifilide.

Le microreazioni possono essere eseguite nei laboratori clinici convenzionali.

Le microreazioni vengono allestite su un vetrino con una goccia di sangue, plasma, siero attivato o non attivato e uno speciale antigene cardiolipina. L'antigene cardiolipina è altamente sensibile ed è un estratto

Cuore bovino arricchito con colesterolo e lecitina. L'MCI può essere eseguito con un metodo quantitativo con diluizione del siero del sangue. Esistono diverse varianti di microreazioni (VDRL, RPR, USR, ART) che differiscono tra loro principalmente per l'antigene utilizzato. Le microreazioni di precipitazione (MRP) sono utilizzate nel nostro paese.

Il vantaggio del metodo espresso è la velocità di ottenere una risposta (dopo 30-40 minuti), una piccola quantità di sangue necessaria per l'analisi (2-3 gocce di plasma o siero). MCI può dare risultati falsi positivi e, in alcuni casi, negativi nelle forme attive di sifilide; pertanto, è vietato fare una diagnosi definitiva con questo metodo. Nei pazienti con sifilide secondaria (nell'1% dei casi), le microreazioni, in particolare VDRL, possono essere negative se stadiate con siero intero e positive se diluite (fenomeno prozoon, “prozoon phenome non”).

Come reazioni di selezione, si raccomanda anche di utilizzare la reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA). La massima sensibilità di questo test si nota nei pazienti non trattati (100%) e trattati (99,6%) con forme precoci e tardive di sifilide. Quando si monitorano i risultati del trattamento, il test non è importante, poiché dà risultati negativi in ​​​​un piccolo numero di casi. La possibilità di utilizzare l'antigene Reiter, la semplicità, l'elevata sensibilità e il basso costo pongono l'RPHA al primo posto tra i metodi per la diagnosi della sifilide. Il suo valore è ulteriormente accresciuto dall'esecuzione automatica.

Test sierologici di conferma diagnostica per la sifilide

Test sierologici standard.

Reazione di Wasserman (RV). Sviluppato da A. Wasserman insieme ad A. Neisser e Brook nel 1906. Storicamente, questo è il primo metodo sierologico per diagnosticare la sifilide. La reazione si basa sul fenomeno della fissazione del complemento (reazione di Borde-Zhang) e determina anticorpi anti-lipidi (reagine) - una reazione classica. Attualmente, la reazione di legame del complemento viene eseguita anche con antigeni treponemici specifici (reazione non classica).

Gli antigeni lipidici utilizzati in RV sono antigeni incompleti - apteni. Non possiedono capacità immunogena. Dopo un trattamento speciale, questi apteni acquisiscono le proprietà di antigeni a tutti gli effetti. Gli antigeni preparati da treponemi culturali e patogeni sono antigeni completi.

In RV vengono utilizzati contemporaneamente due antigeni: cardiolipina e treponemico. L'antigene treponemico è una sospensione di treponemi colturali apatogeni trattati con ultrasuoni. Insieme alle reagine del siero del sangue del paziente, questi antigeni formano un complesso immunitario in grado di adsorbire e legare il complemento. Poiché il complesso formato (regina + antigene + complemento) è invisibile, il sistema emolitico (una miscela di eritrociti di ariete con siero emolitico) è necessario come indicatore per determinare l'inizio della fissazione del complemento.

Se il complemento è legato nella prima fase della reazione (reagine + antigene + complemento), allora l'emolisi non si verificherà, gli eritrociti precipiteranno, facilmente visibili ad occhio nudo (PB positivi).

Se il complemento non è legato nella prima fase a causa dell'assenza di reagenti nel siero del test, viene utilizzato dal sistema emolitico e si verificherà l'emolisi (PB negativo). La gravità dell'emolisi nella reazione di Wasserman è stimata dai vantaggi: completa assenza di emolisi 4+ (PB nettamente positivo), emolisi appena iniziata 3+ (PB positivo), emolisi significativa 2+ (PB debolmente positivo), emolisi completa

Liz - RW è negativo.

Oltre a una valutazione qualitativa di RV, esiste una sua formulazione quantitativa con varie diluizioni di siero sanguigno (1: 10, 1: 20, 1: 80, 1: 160, 1: 320). Il titolo delle reagine è determinato dalla massima diluizione, che dà comunque un risultato nettamente positivo (4+). La formulazione quantitativa di RV è importante nella diagnosi di alcune forme di sifilide e nel monitoraggio del successo della terapia.

La reazione di Wasserman non è molto sensibile. È negativa all'inizio fase primaria, è negativo in 1 / pazienti con sifilide terziaria attiva con lesioni della pelle, delle mucose, delle ossa, degli organi interni, del sistema nervoso centrale, sifilide congenita tardiva, soprattutto se i pazienti sono stati trattati con antibiotici in passato.

Nel periodo primario della sifilide, RV diventa positivo 2-3 settimane dopo la comparsa di un hard chanc o 5-6 settimane dopo l'infezione; nel periodo secondario, quasi il 100% dei pazienti; 50%, paralisi progressiva - 95-98 %.

Dopo la fine del trattamento specifico della sifilide fresca sieropositiva primaria e secondaria, la reazione diventa negativa entro 1,5-7-8 mesi. Nelle forme tardive di sifilide, può lunghi anni rimangono positivi nonostante il trattamento aggiuntivo (sieroresistenza). Per aumentare la sensibilità del camper messo al freddo.

Le reazioni sedimentarie (Kahn, Zaks - Vitebsky, Meinik) all'estero per lungo tempo sono state le principali per la diagnosi della sifilide. Nel nostro paese, hanno necessariamente integrato il camper. L'essenza immunologica delle reazioni sedimentarie non è diversa da RV, ma per esse vengono preparati antigeni più concentrati che, interagendo con le reagine, danno un sedimento visibile all'occhio, che viene valutato qualitativamente. Dentro

Tempo di riposo queste reazioni non vengono utilizzate.

Tutti i test sierologici reagin non sono strettamente specifici e possono dare risultati falsi positivi.

Test sierologici falsi positivi per la sifilide. I falsi positivi (non specifici, biologicamente falsi positivi) sono test sierologici positivi per la sifilide in persone che non sono mai state malate e non hanno la sifilide al momento dell'esame.

Nei casi di reazioni sierologiche false positive nel siero del sangue delle persone esaminate, sono presenti solo reagine, ma non sono presenti immobilisine, anticorpi proteici fissanti il ​​complemento e anticorpi determinati nel RIF.

N. M. Ovchinnikov (1987) identifica tre gruppi delle principali cause di reazioni sierologiche false positive alla sifilide:

1) malattie infettive, i cui agenti causali hanno somiglianza antigenica con treponema pallido (febbre ricorrente, framboesia, bejel, pinta, leptosterosi); processi infiammatori, causata da treponemi, saprofiti nel cavo orale e sui genitali);

2) fisiologico e condizioni patologiche portando a cambiamenti nel metabolismo, in particolare lipidico (gravidanza, gotta, tifo, malaria, polmonite, lebbra, endocardite, malattie diffuse del tessuto connettivo, infarto del miocardio, commozione cerebrale, immunizzazione artificiale, malattie oncologiche; avvelenamento da piombo, fosforo, cloroformio; assunzione di sodio salicilato, digitale, ecc.);

3) errori tecnici nella formulazione delle reazioni.

Ci sono reazioni false positive acute e croniche. Le reazioni false positive acute non sono stabili e la loro negatività spontanea avviene all'interno

4-6 mesi Le reazioni croniche rimangono positive per più di 6 mesi.

Le cause delle reazioni false positive biologiche acute sono la gravidanza (soprattutto nelle ultime settimane e nei primi 10 giorni dopo il parto); infiammazione dei polmoni, in particolare, eziologia micoplasmatica; morbillo, infezione da enterovirus, mononucleosi infettiva, vaccinazione, tossicodipendenza, alcolismo. Meno comunemente, si osservano nella tubercolosi attiva, nella scarlattina, nella polmonite virale, nella brucellosi, nella rickettsiosi, nella leptospirosi, nel morbillo, nel linfogranuloma venereo, nella malaria e nella carenza di proteine. Nei pazienti che smettono di assumere farmaci, le reazioni sierologiche false positive per la sifilide persistono fino a 14 mesi. A volte le cause di reazioni sierologiche non specifiche sono traumi estesi, commozione cerebrale, fratture, infarto del miocardio, nonché errori tecnici nella formulazione delle reazioni.

Reazioni sierologiche standard false positive croniche possono essere osservate in pazienti con lebbra, lupus eritematoso sistemico, tiroidite di Hashimoto, reumatismi, periarterite nodosa, cirrosi epatica, sarcoidosi, sclerodermia generalizzata, porpora da crioglobulina, tumori maligni, malaria, tubercolosi, brucellosi, leptospirosi, mononucleosi infettiva , diabete mellito, malattie del sangue, ipertensione, alcolismo cronico e tossicodipendenza. Con l'età, il numero di falsi positivi aumenta. Nelle donne, sono osservati 4,5 volte più spesso che negli uomini. A volte le cause delle reazioni false positive rimangono poco chiare (reazioni idiopatiche) o si verificano spontaneamente in alcune famiglie.

Le reazioni sierologiche non specifiche sono in media dello 0,03-2,5%. Più spesso sono debolmente positivi e, se positivi, quindi con un basso titolo di reazioni sifilitiche. In alcune malattie (linfomi, leucemia linfatica cronica, artrite reumatoide, cancro del fegato), tuttavia, il loro titolo può essere elevato. Con un secondo studio, le reazioni aspecifiche diventano negative o la loro gravità diminuisce, mentre il titolo dei sieri dei pazienti con sifilide rimane lo stesso o aumenta.

Con risultati non specifici, si osservano discrepanze tra RV e reazioni sedimentarie. A volte c'è una discrepanza tra i risultati delle reazioni durante l'impostazione con antigeni diversi: con un antigene si ottengono risultati positivi, con l'altro - negativi. In caso di forte discrepanza, lo studio dovrebbe essere ripetuto con una nuova porzione di sangue, ma non prima di una settimana. Il criterio più affidabile per le vere indicazioni sifilitiche delle reazioni sierologiche classiche è il risultato ottenuto nell'analisi del sangue usando RIT, sebbene a volte fornisca anche risultati falsi positivi e falsi negativi.

In tali casi, devono essere utilizzati test sierologici per rilevare gli anticorpi IgM più specifici per la sifilide (IgM FTA ABS, IgM FTA 19S).

Gruppo di reazioni sierologiche specifiche

Esistono cinque tipi principali di reazioni specifiche che utilizzano l'antigene treponemico. Differiscono l'uno dall'altro nei metodi di determinazione dei complessi antigene-anticorpo: immunofluorescenza, immobilizzazione, saggio immunoenzimatico, emoagglucinazione, fissazione del complemento.

1. La reazione di immunofluorescenza (RIF) occupa una posizione centrale tra le reazioni specifiche.

Il suo principio sta nel fatto che il siero studiato viene trattato con un antigene, che è un pallido treponema del ceppo Nichols, ottenuto da orchite di coniglio, essiccato su vetrino e fissato con acetone.

Dopo il lavaggio, il farmaco viene trattato con siero luminescente contro le globuline umane. Il complesso fluorescente (globulina antiumana + tioisocianato di fluoresceina) si lega alla globulina umana sulla superficie del treponema pallidum e può essere identificato mediante microscopia a fluorescenza.

Per la sierodiagnosi della sifilide vengono utilizzate diverse modifiche del RIF:

A) reazione di immunofluorescenza con assorbimento (RIF6Abs.). Gli anticorpi di gruppo vengono rimossi dal siero del test utilizzando treponemi in coltura distrutti dagli ultrasuoni, il che aumenta notevolmente la specificità della reazione. Poiché il siero del test è diluito solo 1:5, la modifica mantiene un'elevata sensibilità. Secondo la sensibilità e la specificità di RIF Abs. non è inferiore alla reazione di Nelson (RIT) ed è molto più semplice di quest'ultima nell'impostazione. RIF ass. diventa positivo all'inizio della 3a settimana dopo l'infezione (prima della comparsa di un hard chancre o contemporaneamente ad esso) ed è un metodo di sierodiagnosi precoce della sifilide. Abbastanza spesso, il siero rimane positivo anche diversi anni dopo il trattamento completo della sifilide precoce e nei pazienti con sifilide tardiva - per decenni.

Indicazioni per l'impostazione di RIF Abs.:

Reazione di Wasserman positiva nelle donne in gravidanza in assenza di dati clinici e anamnestici a favore della sifilide;

Reazione positiva di Wasserman in persone con varie malattie somatiche e infettive;

Reazione negativa di Wasserman nelle persone con manifestazioni cliniche di sifilide (metodo di diagnosi precoce della sifilide).

Transizione di RIF positivo Abs. in negativo, a seguito del trattamento, è un criterio assoluto per il successo del trattamento antisifilitico.

Risultati falsi positivi RIF Abs. notato in donne in gravidanza, alcolisti, pazienti con artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico e discoide, sclerodermia, malattia mista del tessuto connettivo, cirrosi epatica. A volte la reazione è positiva persone sane. Inoltre, potrebbero esserci errori tecnici;

B) reazione IgM6RIF6Abs. È stato affermato sopra che nei pazienti con sifilide precoce, le IgM compaiono nelle prime settimane della malattia, che, in determinato periodo sono portatori delle proprietà specifiche del siero. Nelle fasi successive della malattia, le IgG iniziano a predominare. La stessa classe di immunoglobuline è anche responsabile di risultati falsi positivi, poiché gli anticorpi di gruppo sono il risultato di un'immunizzazione a lungo termine con treponemi saprofiti (cavità orale, organi genitali, ecc.).

Lo studio separato delle classi di Ig è di particolare interesse nella sierodiagnosi della sifilide congenita, dove gli anticorpi antitreponemici sintetizzati nel corpo del bambino saranno IgM e le IgG saranno di origine materna. Reazione IgM RIF Abs. si basa sull'uso di un coniugato anti-IgM nella seconda fase invece della globulina fluorescente anti-umana.

Indicazioni per l'impostazione di questa reazione:

Sierodiagnosi di sifilide congenita, poiché la reazione esclude IgG di derivazione materna che attraversano la placenta e può determinare un falso positivo per RIF Abs se il bambino non ha la sifilide attiva;

Differenziazione della reinfezione (reinfezione) dalla recidiva della sifilide, in cui ci saranno anticorpi RIF positivi, ma anticorpi RIF IgM negativi;

Valutazione dei risultati del trattamento della sifilide precoce: con trattamento completo di IgM RIF Abs. cambia da positivo a negativo. Durante la messa in scena di questa reazione, in rari casi, si possono osservare risultati falsi positivi e falsi negativi;

C) reazione 19SIgM6RIF6Abs. Questa modifica RIF si basa sulla separazione preliminare di molecole 19SIgM più grandi da molecole 7SIgG più piccole del siero in esame. Questa separazione può essere effettuata utilizzando la filtrazione su gel. Studio nella reazione RIF Abs. il siero contenente solo la frazione 19SIgM elimina tutte le possibili fonti di errore. Tuttavia, la tecnica di reazione (in particolare il frazionamento del siero studiato) è complessa e richiede tempo, il che limita seriamente la possibilità del suo utilizzo pratico.

2. Reazione di immobilizzazione del treponema pallidum (RIT). Questa è la prima delle reazioni specifiche proposte per la sierodiagnosi della sifilide. Il principio della reazione è che quando il siero del paziente viene miscelato con una sospensione di treponemi pallidi patogeni vivi in ​​presenza di complemento, si perde la mobilità dei treponemi pallidi, mentre quando una sospensione di treponemi pallidi viene miscelata con il siero di quelli sani , la mobilità dei treponemi pallidi è preservata a lungo. Gli anticorpi dell'immobilisina rilevati in questa reazione appartengono agli anticorpi tardivi; compaiono più tardi degli anticorpi che fissano il complemento e raggiungono il titolo massimo entro il decimo mese di malattia, quindi la reazione non è adatta come metodo diagnostico precoce. Tuttavia, con la sifilide secondaria non trattata, la reazione è positiva nel 95% dei casi. Con la sifilide terziaria, RIT dà risultati positivi dal 95 al 100% dei casi. Con la sifilide degli organi interni, il sistema nervoso centrale, la sifilide congenita, la percentuale di risultati RIT positivi si avvicina al 100%. La sensibilità e la specificità di RIT è approssimativamente la stessa di RIF Abs., ad eccezione della diagnosi di sifilide precoce. Il RIT negativo come risultato del trattamento completo non si verifica sempre; la risposta può rimanere positiva per molti anni. Le indicazioni per l'impostazione delle reazioni sono le stesse di RIF Abs. Di tutte le reazioni specifiche, RIT è la reazione più complessa e che richiede tempo, pertanto viene utilizzata all'estero solo per l'esame in casi dubbi.

Il RIT falso positivo può essere osservato in pazienti con lebbra, malattie treponematose (pinta, bejel, ecc.), Malattie maligne, lupus eritematoso, malattie cardiovascolari, polmonite. Va tenuto presente che il RIT può risultare falso positivo se il siero del test contiene sostanze treponemicide (ad esempio penicilline, tetracicline, eritromicina), che causano l'immobilizzazione aspecifica dei treponemi pallidi, pertanto è impossibile eseguire il test del sangue per RIT prima di 2 settimane dopo la fine degli antibiotici e di altri farmaci antisifilitici.

3. Saggio immunoenzimatico (ELISA). Il principio del metodo è che la superficie di un vettore in fase solida (pozzetti di polistirene o pannelli acrilici) è sensibilizzata con antigeni di treponema pallido. Allora il siero studiato è introdotto in tali pozzi. In presenza di anticorpi contro il treponema pallidum nel siero, si forma un complesso antigene-anticorpo associato alla superficie del vettore. Nella fase successiva, nei pozzetti viene versato siero anti-specie (contro le globuline umane) marcato con un enzima (perossidasi o fosfatasi alcalina). Gli anticorpi marcati (coniugati) interagiscono con il complesso antigene-anticorpo, formando un nuovo complesso. Per la sua rilevazione, una soluzione di substrato (5 acido aminosalicilico) viene versata nei pozzetti. Sotto l'azione dell'enzima, il substrato cambia colore, il che indica un risultato positivo della reazione. In termini di sensibilità e specificità, il metodo è vicino a RIF Abs. Le indicazioni per ELISA sono le stesse di RIF Abs. Sono state sviluppate varianti macro e micro di ELISA. La risposta può essere automatizzata.

4. La reazione di emoagglutinazione indiretta (RPHA). Il principio della reazione è che gli eritrociti formalinizzati e tannizzati, sui quali vengono adsorbiti gli antigeni del treponema pallidum, vengono utilizzati come antigene. Quando un tale antigene viene aggiunto al siero del paziente, gli eritrociti si uniscono - emoagglutinazione. La specificità e la sensibilità della reazione è maggiore rispetto ad altri metodi per rilevare gli anticorpi contro il treponema pallido, a condizione che l'antigene sia di alta qualità. La reazione diventa positiva alla 3° settimana dopo l'infezione e rimane per tanti anni dopo la guarigione. Il numero di risultati falsi positivi e falsi negativi è piccolo. È stato sviluppato un micrometodo per questa reazione, nonché una reazione di microemoagglutinazione automatizzata. Un analogo di questa reazione all'estero è TRHA (T. pallidum haemagglutination).

5. La reazione di emoassorbimento in fase solida (IgM6SPHA) (IgM - Solid phase haemabsorption). Questa è una nuova reazione sierologica che apparentemente soddisfa tutti i requisiti per i metodi di sierodiagnosi della sifilide. La reazione è altamente sensibile e specifica, tecnicamente facile da eseguire, diventa positiva dalla 2a settimana dopo l'infezione. E sebbene non ci sia ancora abbastanza materiale fattuale per una valutazione obiettiva dei suoi vantaggi e svantaggi, la reazione sembra essere molto promettente. Il suo principio è che le pareti dei pozzetti di un pannello di polistirene sono rivestite con anti-IgM contro il siero umano. Quindi il siero del test viene versato nei pozzetti con uno speciale diluente assorbente. Nella terza fase, ai pozzetti viene aggiunto un diagnostico eritrocitario.

In casi positivi si verifica l'emoagglutinazione - gli eritrociti sono fissati sulle pareti dei pozzetti, in casi negativi - gli eritrociti si depositano sul fondo dei pozzetti sotto forma di un disco. La reazione può essere fornita in versioni qualitative e quantitative ed è disponibile per l'automazione.

Il ruolo delle reazioni sierologiche nella valutazione dell'efficacia della terapia. Le reazioni sierologiche sono un indicatore dell'efficacia del trattamento. Devono essere eseguiti prima, durante e dopo il trattamento antisifilitico. Nella sifilide primaria, questo è particolarmente importante per determinare la durata del trattamento, e nelle forme secondarie e di altro tipo di sifilide, per valutare i risultati del trattamento.

Numerosi studi hanno stabilito la tempistica approssimativa delle reazioni sierologiche negative in pazienti con varie forme cliniche di sifilide dopo la fine di un trattamento specifico a tutti gli effetti. In alcuni pazienti, tuttavia, nonostante il trattamento completo, le reazioni sierologiche rimangono positive dopo di esso. In questi casi si può parlare di sieroresistenza dei pazienti trattati o di reazioni sierologiche persistentemente positive.

Allo stesso tempo, la definizione spesso usata di "sifilide sieroresistente" è da considerarsi errata, poiché presuppone che una persona affetta da sifilide abbia reazioni sierologiche positive. Le cause della sieroresistenza rimangono in gran parte poco chiare. Secondo N. M. Ovchinnikov e T. V. Vasilyev (1987), causa comune la sieroresistenza non esiste. È anche impossibile rispondere inequivocabilmente se è necessario continuare il trattamento di tali pazienti. Le principali cause di sieroresistenza sono:

Trattamento tardivo e incompleto del paziente;

La presenza di malattie concomitanti croniche nei pazienti con sifilide (tubercolosi, malaria, ecc.);

La presenza di treponemi in focolai difficili da raggiungere per l'azione degli antibiotici (soprattutto se sono in forma alterata o in fagosomi polimembrana);

La transizione dei treponemi pallidi in forme difficili da rispondere all'azione della penicillina (forme L, cisti, granuli), nonché la presenza nel corpo del paziente di flora che produce penicillinasi, che neutralizza completamente o parzialmente la penicillina; la presenza di treponemi nei fagosomi polimembrana delle cellule del corpo, che rende i treponemi inaccessibili all'azione di antibiotici e anticorpi;

Disturbi del metabolismo lipidico.

C'è anche un punto di vista secondo cui la sieroresistenza nelle persone che hanno ricevuto un trattamento specifico a tutti gli effetti e non hanno alcun segno di sifilide è il risultato di reazioni autoimmuni che si verificano nel corpo (autoallergia). È possibile che in alcune persone la sieroresistenza sia una traccia di reazione anamnestica anche in assenza di treponema pallidum. Pertanto, la questione delle cause della sieroresistenza e della necessità di continuare il trattamento dovrebbe essere decisa individualmente.

Tecnica per il prelievo di sangue per reazioni sierologiche.

Il sangue per la ricerca su RV, RIF e RIT viene prelevato dalla vena cubitale a stomaco vuoto o non prima di 4 ore dopo un pasto con una siringa o un ago (per gravità). 5-7 ml di sangue vengono versati in una provetta pulita (una provetta per RIT deve essere appositamente preparata e sterile).

Il sangue per l'esame con il metodo espresso viene prelevato dalla punta del dito, come si fa quando lo si prende per la VES, ma viene prelevato un altro capillare. È inoltre possibile utilizzare il metodo espresso con siero di sangue ottenuto mediante prelievo venoso.

Se è richiesto il test, alcuni laboratori possono inviare sieri asciutti invece del sangue. Per fare ciò, il giorno successivo al prelievo di sangue, il siero viene separato dal coagulo. Quindi componi

1 ml di siero in una siringa e versarlo sotto forma di due cerchi separati su una striscia di carta da lettere spessa, carta oleata o cellophane di 6-8 cm Sul bordo libero della carta, cognome, iniziali e data del paziente di prelievo di sangue sono inscritti. Il siero su carta, protetto dalla luce solare diretta e dalla polvere, viene lasciato fino al giorno successivo alle temperatura ambiente; si asciuga sotto forma di piccoli cerchi di una pellicola vetrosa giallo brillante. Successivamente, le strisce di carta con siero essiccato vengono avvolte allo stesso modo della polvere farmaceutica e inviate al laboratorio indicando la diagnosi e il motivo dello studio.

Studio del liquido cerebrospinale. La diagnostica liquorologica è estremamente importante per stabilire la diagnosi di neurosifilide, nonché per determinare la cura di un paziente affetto da sifilide. Studio di laboratorio del liquido cerebrospinale

Si raccomanda di produrre prima della cancellazione dopo un appropriato controllo clinico e di laboratorio. Va tenuto presente che in alcuni casi, il liquido cerebrospinale patologico è possibile con test sierologici standard negativi.

Il liquido cerebrospinale normale è incolore, trasparente, non forma sedimenti durante la conservazione, la sua densità relativa è 1006-1007; pH 7,35–7,4; contenuto proteico da 10 a 25 mg%; in 1 ml di liquido cerebrospinale normale può contenere da 0 a 3–5–7 elementi formati.

Per determinare specifici cambiamenti sifilitici nel liquido cerebrospinale, si raccomandano i seguenti test: determinazione del contenuto proteico totale, conteggio degli elementi formati, reazioni globuliniche, reazione di Wassermann con tre diluizioni del liquido cerebrospinale e reazione colloidale con cloruro d'oro (Lange reazione), RIT, RIF 10 e RIFc (reazione di immunofluorescenza con liquido cerebrospinale intero non diluito).

Determinazione delle proteine ​​totali. Nel liquido cerebrospinale patologicamente alterato di un paziente con sifilide, aumenta la quantità di proteine. Questo viene determinato in diluizioni graduali del liquido cerebrospinale con una soluzione isotonica di cloruro di sodio da 1:5 a 1:80.

Determinazione quantitativa degli elementi formati.

Il CSF normale, di regola, contiene singoli elementi formati (linfociti). Un aumento del numero di elementi formati e la comparsa di plasmacellule e monociti insieme ai linfociti durante la pleiocitosi indica un cambiamento patologico nel liquido cerebrospinale.

Reazioni globuliniche. Importante nella diagnosi della patologia CSF è la determinazione nel liquido cerebrospinale della frazione pesante delle proteine ​​- globuline. Le reazioni globuliniche includono le reazioni Nonne-Apelt e Pandey, che si basano sulla proprietà di alcuni sali in determinate concentrazioni di precipitare selettivamente le globuline dal liquido cerebrospinale.

Reazione di Lange (reazione con una soluzione colloidale di cloro oro). Il principio della reazione si basa sul fatto che le soluzioni colloidali d'oro, che non cambiano sotto l'influenza di diluizioni graduali del normale liquido cerebrospinale, nelle stesse condizioni nel liquido cerebrospinale patologicamente alterato in presenza di elettroliti (soluzione di cloruro di sodio) subiscono una variazione del grado di dispersione in funzione della diluizione di questo fluido. Il processo è espresso da un cambiamento nel colore della soluzione colloidale durante la precipitazione. La reazione di Lange con una soluzione colloidale di cloruro d'oro ha un valore sia diagnostico che diagnostico differenziale nella diagnosi precoce del danno sifilitico al sistema nervoso.

Reazione di Wassermann con liquido cerebrospinale.

Nella sifilide, il liquido cerebrospinale può contenere reagine e anticorpi antitreponemici che fissano il complemento, che sono determinati dagli antigeni corrispondenti. Non c'è complemento nel liquido cerebrospinale, quindi la reazione di Wasserman viene eseguita con liquido cerebrospinale non inattivato. Il liquido cerebrospinale viene esaminato nella reazione di Wasserman non diluito in un volume di 0,5 ml e diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio 1:1 e 1:4.

È stato stabilito che le reazioni di Wasserman nettamente positive e positive con il liquido cerebrospinale sono la prova della presenza di un'infezione sifilitica nel soggetto, ma bisogna tenere presente che i risultati negativi della reazione di Wasserman non escludono completamente la sifilide. In questi casi è necessario predisporre altre reazioni.

RIF e RIT nel liquido cerebrospinale. Si pensa ora che queste reazioni del liquido cerebrospinale siano completamente specifiche della sifilide. RIF in questi casi viene utilizzato nelle modifiche RIF 10 e RIFts. I metodi di impostazione e contabilizzazione dei risultati di RIF e RIT nel liquor vengono eseguiti allo stesso modo dello studio del sangue.

Diagnosi di neurosifilide attiva. Per valutare l'attività della neurosifilide, puoi usare empirico

Criteri di Skye proposti nel 1949 da Datter e Thomas:

1) la neurosifilide può essere asintomatica anche in presenza di attività pronunciata processo patologico nel sistema nervoso centrale; l'assenza di sintomi clinici non è indicativa flusso luminoso neurosifilide;

2) l'attività della neurosifilide non è determinata da reazioni standard e sierologiche positive; un criterio più affidabile è la loro combinazione con l'aumento della citosi e la quantità totale di proteine ​​​​nel liquido cerebrospinale;

3) quando la neurosifilide è curata, la citosi nel liquido cerebrospinale diventa normale 3-4 mesi dopo la fine della terapia, mentre le reazioni sierologiche standard quantitative e le proteine ​​totali tornano alla normalità molto più tardi;

4) nei pazienti con neurosifilide attiva, dopo il trattamento con penicillina, può esserci una tendenza alla normalizzazione del liquido cerebrospinale, che non esclude la possibilità di una ricaduta della malattia. Le recidive di neurosifilide, tuttavia, si verificano raramente prima di 1 anno dopo la fine della terapia. Se la normalizzazione della citosi nel liquido cerebrospinale, la quantità totale di proteine ​​​​e le reazioni sierologiche standard non si verificano 6 mesi dopo la fine del terapia specifica, dolorosamente mostrato ritrattamento anche in assenza di sintomi clinici di neurosifilide.

Oltre ai criteri di cui sopra negli Stati Uniti, la neurosifilide attiva viene rilevata utilizzando il test di reazione IgM SPHA, RIF Abs. e RPG. Se la prima reazione è positiva, il paziente ha una neurosifilide attiva. Le ultime due reazioni consentono di escludere un'infezione sifilitica del sistema nervoso centrale.

Metodi per rilevare il treponema pallido. nel modo migliore il rilevamento del treponema pallido è un metodo di ricerca nel campo oscuro di un microscopio, che consente di osservare il treponema in uno stato vivente con tutte le caratteristiche della sua struttura e movimento.

Il materiale per la ricerca è prelevato principalmente dalla superficie di hard chancre e papule erosive. Devono prima essere puliti con lozioni da una soluzione isotonica di cloruro di sodio da vari contaminanti e medicinali esterni precedentemente utilizzati.

Prima di prelevare il materiale, la superficie dell'ulcera dura (o altra sifilide) viene asciugata con una garza, quindi l'infiltrato viene catturato con due dita della mano sinistra (in un guanto di gomma) e leggermente schiacciato dai lati, e l'erosione viene delicatamente accarezzato con un'ansa di platino o un batuffolo di garza di cotone fino a quando appare fluido tissutale (senza sangue). ). Una goccia del liquido risultante viene trasferita ad ansa su un sottile vetrino precedentemente sgrassato con una miscela di alcool ed etere, miscelata con altrettanta soluzione isotonica di cloruro di sodio e coperta con un sottile vetrino coprioggetti.

La preparazione preparata con treponemi vivi è microscopica in un campo scuro. Per ottenerlo è necessario sostituire il condensatore del microscopio con uno speciale, cosiddetto condensatore paraboloide, e mettere una goccia di olio di cedro o acqua distillata sulla sua lente superiore (sotto un vetrino). In assenza di un condensatore paraboloide, è possibile utilizzare un normale condensatore se un cerchio di carta nera spessa è attaccato alla superficie superiore della sua lente inferiore in modo tale che rimanga uno spazio di 2-3 mm lungo il bordo della lente . Per evitare lo spostamento del cerchio, quando lo ritagli, lascia 4 sporgenze che si appoggino al telaio metallico dell'obiettivo.

Microscopia in campo oscuro. Il treponema pallido sembra molto delicato e mobile, debolmente luminoso con una lucentezza argentea in una spirale o una linea tratteggiata a causa dell'illuminazione più brillante della parte convessa dei ricci. Ha quattro tipi di movimenti attivi:

1. flessione, in cui oscilla come un pendolo;
2. rotante attorno all'asse longitudinale;
3. progressivo, in cui alternativamente veloce, poi lento movimento in avanti;
4. contrattile - movimento ondulatorio dell'intero corpo del treponema.

Se i risultati dello studio sono negativi, si consiglia di applicare una benda cambiata frequentemente con soluzione isotonica di cloruro di sodio per 24 o 48 ore per pulire l'ulcera o l'erosione dalla flora secondaria, dopodiché lo studio viene ripetuto. Con più risultati negativi ripetuti, viene esaminato il punto dai linfonodi ingrossati.

Diagnosi sierologica della sifilide. Le reazioni sierologiche sono le più importanti metodo ausiliario riconoscere la sifilide Con il loro aiuto viene stabilita l'efficacia del trattamento, viene previsto il decorso della malattia, vengono risolte le domande sul completamento del trattamento e sul monitoraggio dei pazienti.

La gravità delle reazioni sierologiche è indicata da croci: nettamente positivo 4+, positivo 3+, debolmente positivo 2+ o 1+ e negativo -. Oltre a una valutazione qualitativa, vengono utilizzate anche reazioni quantitative con varie diluizioni di siero (da 1:10 a 1:320 e oltre).

Video sulla sifilide:

Attualmente, il complesso delle reazioni sierologiche (CSR) per la diagnosi della sifilide comprende:

1. reazione di fissazione del complemento (RSK) con antigeni treponemici e cardiolipina;
2. microreazione di precipitazione (MRP);
3. reazione di immobilizzazione del treponema pallido (RIT, provetta e melange);
4. reazione di immunofluorescenza (RIF) nelle modifiche: RIF con assorbimento - RIF-abs.; con siero di sangue e sangue capillare; RIF-200; RIF con liquido cerebrospinale intero - RIF-c. (prestazioni di qualità).

MCI viene effettuato sia nei laboratori sierologici (in quanto parte del complesso CSR), sia separatamente nei laboratori di diagnostica clinica per una più ampia copertura della popolazione. MCI esamina le persone sottoposte a visite mediche periodiche per malattie sessualmente trasmissibili. MCI è un test di screening, non un test diagnostico; se è positivo, la diagnosi di sifilide non viene stabilita e il soggetto viene inviato a un dermatovenereologo, che deve sottoporlo a un esame clinico e organizzare un esame del sangue per la CSR.

DAC utilizzato per diagnosticare tutte le forme di sifilide, controllo efficacia del trattamento, esami di persone che hanno avuto contatti sessuali con pazienti affetti da sifilide, persone con sospetto clinico e anamnestico di sifilide, pazienti in ospedali psichiatrici e neurologici, donatori e donne incinte, comprese le persone finalizzate all'interruzione artificiale della gravidanza.

RSK al freddo viene utilizzato in caso di ottenimento di un'analisi negativa quando si utilizza il metodo termostatico per la diagnosi di tutte le forme di sifilide.

Si consiglia di eseguire la RIT in caso di reazioni sierologiche standard positive alla sifilide in soggetti senza segni clinici e anamnestici di sifilide. Il RIT è considerato positivo con immobilizzazione dal 51 al 100% del treponema, debolmente positivo - dal 31 al 51%, dubbio - dal 21 al 30%, negativo - dallo 0 al 20%.

RIT e RIF necessario per la diagnosi di forme latenti e tardive di sifilide; riconoscere risultati falsi positivi di CSR e MR, soprattutto in pazienti gravide e somatiche; con sospetto clinico ed epidemiologico di sifilide, nonché per stabilire la cura della sifilide.

RIF-ass. si consiglia di utilizzare durante l'esame di persone che hanno avuto contatti sessuali con pazienti con sifilide, poiché diventa positivo prima di altre reazioni. RIF-ass. è consigliabile per le forme di sifilide, accompagnate da una bassa concentrazione di anticorpi antitreponemici nel sangue.

Tecnica per il prelievo di sangue per reazioni sierologiche. Il sangue per la ricerca su RSK, RIF e RIT viene prelevato dalla vena cubitale a stomaco vuoto con una siringa o un ago (per gravità). La siringa e l'ago devono essere lavati dopo la sterilizzazione con soluzione isotonica di cloruro di sodio (non possono essere lavati con acqua, alcool, acidi, alcali). 5-7 ml di sangue vengono prelevati in una provetta pulita e asciutta.

Il sangue per la ricerca con il metodo espresso viene prelevato dal dito o dalla vena cubitale.

Se necessario, al posto del sangue possono essere inviati sieri secchi per la ricerca in laboratori remoti. Per fare ciò, il giorno successivo al prelievo del sangue, il siero viene separato dal coagulo. Quindi aspirare 1 ml di siero in una siringa e versarlo in due cerchi separati su una striscia di carta da lettere, carta oleata o cellophane misura 6

Prima e più accuratamente viene rilevata la sifilide, più facile è il trattamento e maggiore è la probabilità che vada bene per il paziente.

L'obiettivo per tutti i test di laboratorio è lo stesso: fare una diagnosi in modo univoco e rapido. Ma nessuno dei moderni test high-tech per la sifilide fornisce il risultato in modo inequivocabile e con una precisione del 100%. I vecchi metodi vengono migliorati, ne vengono inventati di nuovi, ma fino ad ora, nella pratica clinica, i medici devono sempre utilizzare una combinazione di diversi test per la sifilide. I medici non possono fare affidamento sul risultato di nessuno.

Esistono così tante varietà di analisi per la sifilide che è impossibile comprendere tutte le abbreviazioni in movimento:

Per la prima volta fu possibile identificare la malattia utilizzando una reazione di laboratorio nel 1906. Questo è merito dello scienziato tedesco August Wassermann, da cui prende il nome la reazione. Da allora è passato molto tempo, il metodo è obsoleto e non viene utilizzato nella pratica, ma la diagnosi di sifilide è ancora fortemente associata all'analisi di RV.

Una persona potrebbe aver bisogno di essere testata per la sifilide per una serie di motivi.
La primissima ragione che viene in mente è quando si sospetta un'infezione, e in pratica non è la più comune. In questo caso, è importante capire che l'infezione ha un periodo di incubazione (dal momento dell'infezione alla formazione di un hard chancre) e un periodo sieronegativo primario (hard chancre nelle prime tre settimane) - in questo momento, il i test saranno negativi. Pertanto, se i timori sono gravi, i test vengono ripetuti dopo alcune settimane.

Più spesso, le persone che non sospettano alcuna infezione devono essere testate per la sifilide. Questo di solito accade quando si fa domanda per un posto di lavoro (l'analisi è inclusa nel libretto medico) e durante le visite mediche periodiche (visite mediche). È inoltre obbligatorio donare il sangue per la sifilide:

• donatori
• donne nelle prime settimane di gravidanza - due volte, previa registrazione presso la clinica prenatale e presso l'ospedale di maternità poche settimane prima del parto,
• pazienti prima dell'intervento chirurgico o di qualsiasi altro intervento medico invasivo ( FGD, broncoscopia, ecc.).

Alla fine dell'articolo, abbiamo risposto alle domande più comuni delle persone che si trovano di fronte alla diagnosi di sifilide. Non c'è tempo per leggere i dettagli sui metodi di ricerca -.

Tutti i tipi di ricerca sulla sifilide

Esistono 2 gruppi principali di metodi di ricerca per la sifilide: diretti e indiretti.

• metodo diretto- questo è uno studio in cui l'infezione stessa viene cercata nel biomateriale - i singoli rappresentanti dell'agente patogeno nel suo insieme o i loro pezzi - DNA.
• Metodi indiretti(test sierologici) è un test in cui cercano di rilevare gli anticorpi contro l'agente eziologico della sifilide nel sangue. La logica è questa: se viene trovata una risposta immunitaria caratteristica di un qualche tipo di infezione, allora c'è un'infezione stessa che ha causato questa risposta immunitaria.

metodi diretti,- il più affidabile: se il batterio viene "colto in flagrante", la presenza della malattia è considerata provata. Ma il treponema pallidum è difficile da rilevare e i risultati negativi del test non escludono la presenza di infezione. Ha senso condurre questi studi solo in presenza di eruzioni cutanee e solo nella prima forma di sifilide - fino a due anni di malattia. Quelli. è impossibile determinare la sifilide latente o le sue forme tardive con questi metodi, pertanto, nella pratica clinica, vengono utilizzati raramente e solo per confermare altri test.

I metodi diretti includono: Microscopia in campo oscuro, Infezione di animali da laboratorio, PCR .

1. Microscopia in campo oscuro ( TPM) - esame del treponema pallido al microscopio. Il materiale è prelevato da un duro chancre o da un'eruzione cutanea. Il metodo è economico e veloce e rileva la sifilide proprio all'inizio del periodo primario, quando gli esami del sangue per la sifilide sono ancora negativi. Ma i batteri, che si trovano in piccole quantità nelle eruzioni cutanee, non possono facilmente entrare nel raschiamento. Inoltre, i treponemi pallidi possono essere facilmente confusi con altri abitanti della cavità orale, del canale anale, ecc.
2. L'infezione degli animali da laboratorio è un metodo molto costoso e scrupoloso, utilizzato solo nella pratica della ricerca.
3. PCR- un metodo relativamente nuovo, stanno cercando DNA infezioni. Qualsiasi tessuto o liquido che può contenere treponemi pallidi è adatto per la ricerca: sangue, urina, secrezioni prostatiche, eiaculato, raschiamenti da eruzioni cutanee, dal tratto genito-urinario, dall'orofaringe o dalla congiuntiva. L'analisi è molto sensibile e specifica. Ma complicato e costoso. Assegnalo in caso di risultati discutibili di altri test.

Metodi indiretti, sono anche reazioni sierologiche, sono alla base dello studio di laboratorio della sifilide. Sono questi metodi che vengono utilizzati per lo screening di massa della popolazione, per confermare la diagnosi e controllare il trattamento. I metodi di ricerca indiretti sono suddivisi in test non treponemici e treponemici.

I test non treponemici sono notevolmente più economici. Per la loro implementazione, non viene utilizzata la stessa proteina antigenica, specifica per il treponema sifilitico, ma la sua sostituzione, l'antigene cardiolipina. Questi test sono altamente sensibili ma debolmente specifici. Ciò significa che tali test identificheranno chiunque abbia la sifilide e altro: anche le persone sane possono avere risultati falsi positivi. Sono utilizzati per lo screening di massa della popolazione, ma in caso di risultato positivo devono essere confermati da test più specifici: il treponemico. I test ancora non treponemici sono molto utili per valutare l'efficacia del trattamento: quando trattamento efficace il volume degli anticorpi nel sangue diminuisce e il loro titolo diminuisce di conseguenza (parleremo di questi titoli un po 'più in dettaglio). Il risultato più affidabile di questi test non treponemici sarà durante la sifilide precoce, specialmente nel periodo secondario.

I test non treponemici includono:

• Reazione di Wassermann(, Lei Camper, O RSK) è ormai obsoleto e non più in uso, ma a causa della sua forte associazione con la malattia, qualsiasi test utilizzato per lo screening della popolazione per la sifilide viene spesso indicato come tale. Se vedi nella direzione del medico la voce “analisi Camper”- non essere imbarazzato, in laboratorio tutti capiranno sicuramente correttamente e lo faranno RPR.
• Reazione di microprecipitazione (SIG, lei è RMP) è un test semplice ed economico per la sifilide. Precedentemente utilizzato come principale test non treponemico, ora ha lasciato il posto a un test più conveniente e oggettivo RPR-test.
• Test rapido PlasmaRegine (RPR-test) è un test rapido, semplice e conveniente per l'esame di massa della popolazione e il controllo del trattamento. È il principale test non treponemico utilizzato in Russia e all'estero.
• FIDUCIA è una versione più moderna RPR-test. In un altro modo, è indicato come RPR-test con rosso di toludina. In Russia, viene utilizzato solo in un piccolo numero di laboratori.
• VDRL - questa analisi è simile in termini di affidabilità dei risultati RMP, ed è anche inferiore RPR. In Russia, non ha trovato ampia applicazione.
• URSS-test(o la sua modifica - RST-test) - più avanzato VDRL test, tuttavia, in Russia è anche usato molto raramente.

Test treponemici effettuata con antigeni treponemici. Sono più specifici e quindi eliminano più attentamente i sani dai malati. Ma la loro sensibilità è inferiore e tali test possono perdere una persona malata, specialmente in una fase iniziale della malattia. Un'altra caratteristica è che i test treponemici compaiono più tardi di quelli non treponemici, solo tre o quattro settimane dopo la comparsa di un hard chancre. Pertanto, non possono essere utilizzati come screening. Lo scopo principale dei test treponemici è confermare o confutare i risultati dei test non treponemici.

Tuttavia, i risultati dei test treponemici rimarranno positivi per diversi anni dopo trattamento di successo. Per questo motivo, non vengono utilizzati per monitorare l'efficacia del trattamento e inoltre non si basano sui risultati di questi test, a meno che non siano confermati da test non treponemici.

I test treponemici includono:

• Gioco di ruolo (o la sua modifica più moderna - TRRA, TRNA) è una reazione di emoagglutinazione passiva. La principale reazione treponemica attualmente utilizzata all'estero e in Russia. Un test semplice e conveniente per la rilevazione degli anticorpi della sifilide nel corpo.
• ELISA (anti-Tr. pallidum IgG/IgM) - saggio di immunoassorbimento enzimatico, alias ELISA dall'abbreviazione inglese. Questo test può essere eseguito sia con l'antigene della cardiolipina che con il treponemico. Può essere utilizzato sia per lo screening che per la conferma. In termini di affidabilità, non è inferiore Gioco di ruolo ed è anche il test treponemico raccomandato per confermare la diagnosi di sifilide.
• Immunoblotting- questo è un miglioramento più costoso ELISA-test. Utilizzato solo in caso di dubbio.
• BARRIERA BARRIERA - reazione di immunofluorescenza. Analisi tecnicamente difficile e costosa. È secondario, utilizzato per confermare la diagnosi nei casi dubbi.
• COSTA (RIT) - reazione di immobilizzazione (immobilizzazione) di treponemi pallidi. Questa reazione è complessa, lunga nell'esecuzione e di difficile interpretazione del risultato. In alcuni punti è ancora utilizzato, ma gradualmente passa in secondo piano, lasciando il posto a Gioco di ruolo E ELISA.

Decifrare i test sierologici per la sifilide:

Algoritmo per la diagnosi di "sifilide"

Ogni diagnosi consiste di tre pilastri principali della medicina: anamnesi (anamnesi), manifestazioni cliniche(sintomi) ed esami di laboratorio. Se il medico sospetta la sifilide sulla base della storia del paziente e dell'esame esterno del suo corpo, prescrive una serie di test (o una serie di reazioni sierologiche - DAC). Include necessariamente 1 test non treponemico ( RMP O RPR) e 1 test treponemico ( Gioco di ruolo O ELISA). Se i risultati di questi test divergono, viene eseguito un ulteriore test treponemico alternativo ( ELISA O Gioco di ruolo). Questo è lo schema più semplice. In caso di indicatori dubbi, a seconda della situazione, il medico prescrive altri metodi diagnostici.

Test rapido per la sifilide o come determinare la sifilide a casa

C'è un test per la sifilide che puoi fare da solo. Può essere acquistato liberamente in farmacia, costo medio- 200-300 rubli. Il principio di determinazione della malattia è simile a quello non treponemico RPR. I produttori affermano un'elevata precisione, ma in realtà è bassa, non superiore al 70%.

L'algoritmo delle azioni durante il test ricorda un test di gravidanza, viene utilizzato solo il sangue invece dell'urina. Una goccia di sangue viene applicata all'indicatore e il risultato appare entro 10-15 minuti. 1 striscia - il test è negativo, 2 strisce - il test è positivo.
Non raccomandiamo questo metodo diagnostico. In caso di dubbi sulla sifilide, è meglio consultare immediatamente un medico o almeno un laboratorio indipendente. Sarà un po' più costoso e più lungo, ma molto più preciso.

Decifrare i risultati per la sifilide: vantaggi, croci e crediti.

Ulteriori tattiche del medico dipendono dai risultati di alcuni test. I risultati delle analisi di screening sono espressi con croci (più) o in una voce separata:

4 o 3 croci: un risultato positivo, è necessario un ulteriore esame per la sifilide utilizzando altri metodi diagnostici.
2 o 1 incrocio è un risultato dubbio, si consiglia di ripetere il risultato dopo 10 giorni.
0 croci - risultato negativo, la sifilide non è stata rilevata.

In caso di reazione positiva e dubbia, ulteriori ricerche sangue prelevato: diluendolo da 1:2 a 1:1024 e aggiungendo ad ogni titolo ematico una goccia di antigene cardiolipina. Il risultato registra il titolo massimo a cui si è verificata la reazione: maggiore è la diluizione, più valore titolo, maggiore è il numero di treponema pallido nel sangue. Ma il compito principale di determinare il titolo non è calcolare il grado di contaminazione del sangue, ma controllare il successo del trattamento: il trattamento è considerato efficace se il titolo diminuisce di 4 volte in 4 mesi. Entro la fine del trattamento, i risultati dei test non treponemici dovrebbero diventare negativi.

La massima sensibilità dei test di screening si osserva nel periodo secondario della sifilide (100%), leggermente inferiore nel primario (86%) e ancor meno nel terziario (73%).

Sfumature importanti nella diagnosi della sifilide:

1. Quando si eseguono test, sono possibili risultati falsi positivi. Sono particolarmente comuni durante le proiezioni. Se non hai mai avuto la sifilide e i test sono positivi, non dovresti farti prendere dal panico subito, devi fare almeno un'altra analisi alternativa.
2. Ci sono anche risultati falsi negativi. Se c'è il sospetto di sifilide, è meglio ripetere l'analisi dopo alcune settimane.
3. La sifilide curata rimane positiva ai test treponemici per diversi anni o per tutta la vita.

Le domande più comuni sui test per la sifilide

Come fare il test per la sifilide gratuitamente?

Per fare ciò, è necessario contattare la clinica del luogo di residenza e visitare il proprio medico locale, che fornirà un rinvio per l'analisi. Il test della sifilide è gratuito per tutti i residenti RF sotto la politica CHI.

Dove posso fare il test per la sifilide in modo anonimo?

I test anonimi possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio a pagamento, le cliniche per la cura della pelle spesso offrono questo servizio da sole. Inoltre, è possibile testare la sifilide a casa utilizzando test rapidi venduti in farmacia. Tuttavia, va ricordato che un tale test non fornisce un risultato accurato e, se sospetti la sifilide, dovresti consultare un medico.

Quanti giorni dopo il rapporto sessuale posso donare il sangue per la sifilide?

Dopo 1-1,5 mesi. Se si è verificata un'infezione, il test per la sifilide sarà positivo non prima di sette-dieci giorni dopo la comparsa di un'ulcera dura o 4-5 settimane dopo l'infezione. Questo periodo può essere più lungo, quindi se i risultati sono negativi, l'analisi dovrebbe essere ripetuta dopo 2 settimane.

Dove prendono il sangue per la sifilide?

Il sangue per la sifilide viene prelevato più spesso da una vena, ma può anche essere prelevato da un dito. Dipende dal tipo di analisi.

Preparazione. Come fare il test per la sifilide?

Prima di donare il sangue per la sifilide, non puoi mangiare per quattro ore: il sangue deve essere donato a stomaco vuoto. Inoltre, 12 ore prima dell'analisi, non puoi bere alcolici. Questo è importante perché il danno da alcol al fegato può causare test falsi positivi.

Quanto dura in media un test per la sifilide?

I risultati sono generalmente disponibili il giorno successivo. I test rapidi non richiedono più di 30 minuti.

Quale analisi viene eseguita per la sifilide e come si chiama?

Per lo screening, anche quando la malattia non è sospettata RMP(reazione di microprecipitazione), o RPR(test rapido del plasma). A volte tali test di screening sono chiamati reazione di Wasserman.

Se ci sono sospetti o dubbi reali, non si limitano mai a un'analisi. Allo stesso tempo, viene eseguito uno qualsiasi dei gruppi di screening ( RMP O RPR) e uno di uno qualsiasi dei gruppi di test più specifici ( Gioco di ruolo O ELISA), agire ulteriormente in base ai risultati e alla storia del paziente.

Un test per la sifilide può essere sbagliato?

Forse! Probabilità di errore metodi diversi dipende principalmente dal periodo di malattia e dalle condizioni generali del corpo.

I test non treponemici sono più sensibili al culmine della malattia - nel periodo secondario. A causa della loro bassa specificità, spesso danno risultati falsi positivi. Ciò può accadere a causa di febbre, influenza o un'altra malattia infettiva, una recente vaccinazione, malattie croniche e una serie di altri motivi.

I test treponemici sono più sensibili in periodo tardo. Possono anche dare risultati falsi positivi, ma solo se nel corpo sono presenti simili al treponema pallido. batteri patogeni che causano altre malattie: treponematosi non veneree (rara in Russia) o malattia di Lyme (trasmessa attraverso punture di zecche).

I risultati del test falsi negativi sono possibili con tutti i metodi diagnostici. Dipendono dalla risposta immunitaria del corpo: nessuna risposta - nessuna reazione alla sifilide. Ciò è possibile nelle persone con infezione da HIV, nonché immunocompromesse per altri motivi. Inoltre, c'è una reazione inversa: sovrapproduzione di anticorpi, l'effetto "prozona", in cui ci sono così tanti anticorpi che non si lasciano reagire l'un l'altro con l'antigene. Il risultato è un risultato falso negativo.

I test generali possono mostrare la sifilide?

La sifilide non può essere determinata né da un esame del sangue generale né da uno biochimico. Neanche un esame delle urine generale o un normale striscio vaginale lo mostreranno. Tutti gli studi sulla sifilide sono altamente specializzati e ognuno ha il proprio nome. Per qualsiasi altra analisi, è impossibile calcolare se una persona ha la sifilide o meno. Ma cosa mostreranno altri test se una persona ha la sifilide? Analizziamo ciascuno di essi:

Emocromo completo: mostra le principali cellule del sangue: eritrociti, leucociti, piastrine. Alla fine del periodo primario e all'inizio del periodo secondario, i leucociti possono aumentare in una persona, oltre ad aumentare VESè un indicatore di infiammazione. Questi sono indicatori molto aspecifici che indicano semplicemente che il corpo sta combattendo un'infezione batterica. Il resto del test del sangue corrisponderà alle condizioni generali del corpo.

Esame del sangue biochimico: mostra il lavoro di fegato, reni, cuore, pancreas e altri organi. Se la sifilide non ha ancora colpito questi organi e funzionano correttamente, l'esame del sangue sarà normale.

Analisi delle urine: mostra il lavoro dei reni e del sistema endocrino, nonché le condizioni generali del corpo. Se acuto o malattie croniche questi sistemi non sono presenti - l'analisi sarà normale.

Tampone vaginale: determina se c'è un processo infiammatorio o oncologico, così come la dysbacteriosis. È impossibile mettere la sifilide su una tale macchia.

Test treponemici per la sifilide. Descrizione generale.

Per diagnosticare in modo affidabile la sifilide e identificare gli anticorpi antisifilitici nel corpo del paziente (nel siero del sangue o nel liquido cerebrospinale), vengono utilizzate speciali tecnologie di ricerca di laboratorio, i cosiddetti metodi sierologici.

Quando si eseguono test diagnostici per la sifilide, vengono utilizzate varie reazioni sierologiche: agglutinazione, precipitazione, immunofluorescenza, fissazione del complemento, dosaggio immunoenzimatico, ecc. Tutte queste reazioni sierologiche si basano sull'interazione di antigeni e anticorpi.

Vengono chiamati test sierologici specifici treponemico perché questi test utilizzano il treponema pallidum oi suoi antigeni, cioè antigeni di origine treponemica. Lo scopo dei test treponemici è identificare anticorpi specifici contro le strutture antigeniche dell'agente eziologico della sifilide, cioè anticorpi diretti specificamente contro i batteri T. Pallidum stessi e non contro i tessuti corporei danneggiati dal treponema. Anticorpi antitreponemici specifici della classe IgM possono essere rilevati già alla fine della seconda settimana di malattia.

7. Risultati falsi positivi e falsi negativi

Un test PB positivo per la sifilide in persone che non hanno la malattia è chiamato falso positivo. La frequenza di risultati falsi positivi in ​​individui sani è dello 0,2-0,25%. Se la percentuale di risultati falsi positivi aspecifici di RV nelle persone sane è molto bassa, in alcune malattie può essere elevata.

Tutti i risultati non specifici delle reazioni sierologiche possono essere suddivisi nei seguenti gruppi principali:

1. Malattie causate dalla presenza di antigeni comuni in patogeni simili (spirochete): febbre ricorrente, framboesia, bejel, pinta, treponema orale, leptospira.

2. Reazioni positive dovute a cambiamenti nel metabolismo lipidico e cambiamenti nelle globuline sieriche. Questi includono risultati positivi in ​​​​donne in gravidanza con gotta, disturbi della composizione lipidica a seguito di avvelenamento da piombo, fosforo, dopo l'assunzione di salicilato di sodio, digitale, ecc. Queste reazioni dovrebbero includere anche reazioni positive in alcune malattie infettive (tifo, malaria, polmonite , lebbra, endocardite, collagenosi, infarto miocardico, commozione cerebrale, cancro, cirrosi epatica, ecc.)

3. Errori tecnici di condotta. Scelta errata della dose del complemento, non rispetto delle condizioni e dei termini di conservazione dei reagenti, esclusione dei campioni di controllo del siero sanguigno dalla reazione, utilizzo di provette e strumenti contaminati.

8. Modifica della reazione di Wassermann

Esistono modifiche della reazione di Wasserman in versione qualitativa e quantitativa, al freddo, con liquido cerebrospinale.

Modifica di RV al freddo sembrava essere più sensibile. Una caratteristica del metodo per impostare la reazione di Wasserman al freddo sono i regimi di temperatura trifase a cui procede il legame del complemento. Questa reazione è anche associata alla cardiolipina e all'antigene treponemico.

Oltre alla valutazione qualitativa di RW, esiste un metodo per la sua impostazione quantitativa con varie diluizioni di siero sanguigno (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Il titolo della reazione è determinato dalla massima diluizione, che dà ancora un risultato nettamente positivo (4+). La formulazione quantitativa di RV è importante nella diagnosi di alcune forme di sifilide e nel monitoraggio dell'efficacia della terapia.

9. Ambito

In Russia, RSKt fa parte del complesso dei test sierologici standard per la sifilide (SSR).

Viene utilizzata la reazione di Wasserman con antigene treponemico e cardiolipina (RSKt).

• diagnosi di tutte le forme di sifilide,
• controllo sull'efficacia del trattamento,
• esami di persone che hanno avuto rapporti sessuali con un malato di sifilide,
• esami di persone con sospetto clinico e anamnestico di sifilide
• durante l'esame preventivo per la sifilide di pazienti in ospedali psichiatrici e neurologici, donatori e donne incinte, comprese le persone indirizzate all'interruzione artificiale della gravidanza.

Attualmente, per ordine del Ministero della Salute della Federazione Russa, si raccomanda di sostituire RSKT con metodi treponemici più sensibili (ELISA o RPHA).

All'estero, la reazione di Wasserman con l'antigene treponemico non è stata utilizzata nella pratica clinica di laboratorio da molto tempo e non è inclusa nell'elenco dei test standard raccomandati dall'Organizzazione mondiale della sanità.

Complesso di reazioni sierologiche classiche (CSR)

DAC- Questo complesso di reazione utilizzato per la sierodiagnosi della sifilide come metodo standard. Questo complesso di reazioni include la reazione di Wassermann con l'antigene cardiolipina (un estratto dal cuore di un toro arricchito con lecitina e colesterolo) e l'antigene treponemico (una sospensione di treponemi pallidi culturali apatogeni trattati con ultrasuoni), nonché una reazione di microprecipitazione (RMP ) con plasma o siero inattivato, a cui viene posto l'antigene della cardiolipina

La CSR diventa positiva nel mezzo del periodo primario (la sua divisione in sieronegativo e sieropositivo è precisamente determinata dalla CSR), nel periodo secondario la CSR è positiva nel 98-100% dei pazienti e nel periodo terziario - solo nel 60-70 %. Cioè, all'aumentare della durata della malattia, la positività della CSR diminuisce gradualmente.

Vantaggi del KSR:

1) Economicità, semplicità e rapidità di impostazione. Ciò è particolarmente vero per la reazione di microprecipitazione: RMP è attualmente il principale metodo di screening (screening);

2) I test non treponemici sono convenienti da usare per monitorare la cura della sifilide.

Svantaggi della CSR:

1) Soggettività della valutazione dei risultati delle reazioni ("a occhio");

2) Bassa sensibilità nelle forme tardive di sifilide;

3) Mancanza di specificità rispetto ai test più moderni. Quando vengono eseguiti, si notano spesso reazioni false positive (LPR).

LPR può essere dovuto a reattività crociata tra la spirocheta pallida e altri microbi, disturbi del metabolismo lipidico e proteico, instabilità della membrana cellulare e formazione di autoanticorpi. Le LPR si notano nelle infezioni acute (malaria, mononucleosi infettiva, ecc.) e croniche (tubercolosi, lebbra, epatite, borreliosi, ecc.), infarto del miocardio, cirrosi epatica, collagenosi (soprattutto nel LES), oncopatologia, vaccinazione, uso di droghe, abuso di alcol e cibi grassi. Il falso positivo può essere CSR nelle ultime settimane di gravidanza, dopo il parto e in alcune donne durante le mestruazioni. I risultati CSR falsi negativi possono essere associati all'infezione da HIV.

RIT, RIBT - Reazione di immobilizzazione del treponema pallido

Il test di immobilizzazione Treponema pallidum (TPI; Treponema pallidum immobilization test, TPI) è un metodo classico che serve a rilevare specifici anticorpi treponemici. La reazione RIBT utilizza il treponema pallidum T. pallidum patogeno (ceppo Nichols) cresciuto nei testicoli di coniglio come antigene. RIBT si basa sulla perdita di mobilità dei treponemi pallidi vivi dopo l'esposizione agli anticorpi del siero del sangue e del complemento del paziente. I risultati vengono valutati mediante microscopia in campo oscuro. Nonostante il test RIBT sia stato introdotto nella pratica clinica come test specifico per la sifilide, è laborioso, tecnicamente complesso, dispendioso in termini di tempo e costoso da utilizzare.

1. Storia del metodo RIBT

Il test di immobilizzazione del treponema pallidum (TPRT) è in realtà il primo test specifico per la diagnosi della sifilide. Questa reazione fu presentata nel 1949 dai ricercatori americani Nelson e Mayer (R. W. Nelson e M. M. Mayer) e discussa in dettaglio in articoli scientifici nei decenni successivi. In precedenza sono stati fatti tentativi falliti di utilizzare treponemi vivi nei test. Poiché Nelson è riuscito a creare un ambiente in cui i treponemi sono rimasti vitali fino a 8 giorni, la sua ricerca è stata coronata dal successo.

2. Principio del metodo RIBT

Il metodo si basa sul fenomeno della perdita di mobilità da parte dei treponemi pallidi in presenza di anticorpi antitreponemici immobilizzanti del siero del sangue studiato e del complemento in condizioni anaerobiche. L'antigene è un treponema pallido patogeno vivo ottenuto da conigli infettati artificialmente con la sifilide.

3. Impostazione del test RIBT

Il siero del test, il complemento e l'antigene partecipano alla reazione. Il siero del sangue del soggetto viene aggiunto a treponemi vivi ottenuti da tessuti di testicoli di coniglio dopo infezione artificiale. In presenza di anticorpi-immobilizine anti-treponemici nel siero, i treponemi pallidi smettono di muoversi (immobilizzati). Gli anticorpi anti-immobilisina sono anticorpi antitreponemici tardivi.

La reazione viene eseguita con sieri inattivati ​​al calore o con campioni di sieri essiccati su carta oleata (gocce secche). L'inattivazione del siero mediante riscaldamento viene effettuata per 30 minuti ad una temperatura di 56°C. Prima di prelevare il sangue, il soggetto non deve ricevere farmaci, in particolare preparati di penicillina. L'assunzione di farmaci viene annullata per tutta la durata del loro possibile ritardo nell'organismo.

Come antigene vengono utilizzati batteri del ceppo Nichols, ottenuti da un'orchite sifilitica di coniglio di 7-10 giorni (infiammazione testicolare). Il periodo dal momento in cui la reazione è stata impostata alla registrazione dei suoi risultati dura 18-20 ore, pertanto è necessario un ambiente di sopravvivenza per mantenere la vitalità e la buona mobilità dei microrganismi.

RIBT utilizza il complemento di cavia. Per ottenere il complemento, il sangue deve essere prelevato in condizioni sterili da diverse cavie.

In caso di contaminazione batterica, il complemento viene scartato. Non può essere utilizzato nella reazione di immobilizzazione del complemento conservato treponema pallido, tk. è tossico per i microrganismi.

Nella reazione di immobilizzazione viene utilizzato un eccesso di complemento. La sua quantità dipende in gran parte dall'ambiente di sopravvivenza per il treponema pallido.

RIBT viene posto in scatole sterili, precedentemente irradiate con una lampada al quarzo battericida per 45-60 minuti. Ogni siero di sangue viene esaminato in due provette: esperto E controllo. In entrambe le provette vengono aggiunti il ​​siero e l'antigene da testare nelle quantità richieste. Il complemento attivo viene versato nella provetta e la stessa quantità di siero di sangue di cavia inattivato viene versata nella provetta di controllo. Dopo il riempimento, il contenuto dei tubi viene miscelato agitando delicatamente.

RIBT procede in condizioni anaerobiche. Le provette con gli ingredienti vengono poste in un microanaerostato, da cui l'aria atmosferica viene aspirata da una pompa a vuoto e una miscela di gas viene iniettata da una bombola (95 parti di azoto e 5 parti di anidride carbonica). Il microanaerostato con le provette viene posto in un termostato (35°C) per 18-20 ore.

La valutazione dei risultati della RIBT viene effettuata dopo aver tolto le provette dal termostato e dal microanaerostato (ovvero dopo 18-20 ore di esperienza). Con una pipetta Pasteur, una goccia del contenuto della provetta viene applicata su un vetrino, che viene coperto con un vetrino coprioggetti ed esaminato nel campo oscuro di un microscopio (obiettivo 40, oculare 10X). Diversi campi visivi vengono esaminati in diverse parti della preparazione, contando il numero di treponemi pallidi mobili e immobili in ciascuno. Il conteggio inizia con il farmaco dal controllo e poi dalla provetta.

Quando si imposta la reazione, vengono utilizzati 5 studi di controllo: con sieri di sangue ovviamente positivi e negativi, con complemento attivo e inattivato e mezzo di sopravvivenza per treponema pallido. Il siero del sangue di controllo negativo viene utilizzato per giudicare il grado di mobilità del treponema pallido in questo esperimento. Controllo del siero del sangue positivo - per valutare il grado di attività immobilizzante nelle condizioni di questo esperimento. Lo studio del complemento attivo e inattivato e dell'ambiente viene effettuato per determinare il loro effetto sulla mobilità del treponema pallido.

Con una mancanza di complemento nell'esperimento, gli anticorpi immobilizzanti non mostrano correttamente la loro attività e i treponemi rimangono mobili. Pertanto, dopo l'esperimento, viene eseguita la determinazione del complemento residuo per valutare se la mobilità dei treponemi pallidi nelle provette fosse dovuta alla mancanza del complemento. Per questo viene utilizzato un sistema emolitico: una miscela di una sospensione di eritrociti di ariete e siero emolitico diluito conservato in un termostato.

Il complemento residuo viene determinato aggiungendo il sistema emolitico nel volume richiesto a ciascuna provetta. I tubi vengono posti in un termostato a 37° per 45 minuti. Nelle provette sperimentali dovrebbe verificarsi l'emolisi degli eritrociti, nelle provette di controllo dovrebbe esserci un ritardo nell'emolisi. L'assenza di emolisi nelle provette indica una quantità insufficiente di complemento, in questi casi lo studio dovrebbe essere ripetuto. L'esame ripetuto del siero del sangue non viene eseguito solo se si nota l'immobilizzazione del 100% dei treponemi pallidi.

4. Contabilizzazione dei risultati di RIBT

I treponemi immobilizzati vengono contati al microscopio utilizzando la microscopia in campo oscuro. Il ricercatore deve avere l'abilità di valutare il movimento dei treponemi. Dovrebbe prestare attenzione all'intensità dei movimenti compiuti dal pallido treponema. In questo batterio non è sempre possibile osservare contrazioni ondulatorie e movimenti di flessione, a volte solo rotazionali. Dovresti anche essere in grado di distinguere i movimenti attivi dei treponemi dal movimento con flusso fluido.

Per valutare i risultati della reazione, viene calcolata la percentuale di immobilizzazione dei treponemi pallidi, ovvero il rapporto tra treponemi mobili e immobili nell'esperimento (con complemento attivo) e controllo (con complemento inattivo) secondo la formula:

X \u003d (M - C) × 100 / M

dove M è il numero di treponemi mobili nel controllo; C - il numero di treponemi mobili nell'esperimento; X - % di immobilizzazione. Nel lavoro pratico, la percentuale di immobilizzazione viene determinata secondo una tabella precompilata utilizzando la formula sopra.

La reazione di immobilizzazione del treponema pallido è stimata come

• positivo durante l'immobilizzazione 51 - 100% treponem,
• debolmente positivo: 31 - 50% treponemi immobili,
• dubbio: 21 - 30% treponemi immobili,
• negativo: 0 - 20% treponemi immobili.

La reazione di immobilizzazione del treponema pallido diventa positiva alla fine del primario - l'inizio del periodo secondario della sifilide (dalla 7-8a settimana dal momento dell'infezione e oltre). Allo stesso tempo, RIBT è di scarsa utilità per diagnosticare le prime fasi della sifilide, poiché gli anticorpi che immobilizzano il treponema pallido e sono determinati nella reazione compaiono solo 3-6 settimane dopo l'infezione. Gli anticorpi-immobilisine appartengono alla classe delle immunoglobuline IgG. Appaiono nel sangue più tardi delle reagine (anticorpi anticardiolipina), più tardi degli anticorpi della fluoresceina (vengono rilevati RIF ed ELISA) e delle precipitine (vengono rilevati RMP).

In futuro, RIBT rimane positivo. C'è un'alta sensibilità della reazione nelle forme tardive di sifilide. Con sifilide secondaria, tardiva, neurosifilide, sifilide congenita, un risultato RIBT positivo viene registrato nel 95-100% dei casi. Con la sifilide terziaria, con lesioni specifiche degli organi interni, del sistema nervoso, quando RV è spesso negativo, RIBT dà risultati positivi nel 98-100% dei casi.

RIBT è stato a lungo riconosciuto come il test più specifico per la sifilide. Secondo la letteratura, la specificità della RIBT è del 99%, la sensibilità varia dal 79 al 94%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità di RIBT (in totale, per tutti gli stadi della sifilide) è dell'87,7%.

7. Ambito del metodo

L'ambito di RIBT si sta gradualmente restringendo a causa della durata dell'impostazione, dell'elevato costo e dell'intensità del lavoro. RIBT è un'analisi piuttosto complessa e costosa che richiede personale altamente qualificato e la presenza di un vivaio. A questo proposito, l'uso di questo metodo negli ultimi anni è stato notevolmente ridotto. Negli Stati Uniti, questo test è attualmente utilizzato solo nei laboratori di ricerca.

Sulla base della complessità e dell'elevato costo di RIF e RIBT, ha senso utilizzarli per diagnosticare in ritardo e forme nascoste sifilide. RIBT mantiene la sua posizione di "arbitro della reazione" nella diagnosi differenziale delle prime forme latenti di sifilide e dei risultati falsi positivi. Questa reazione può essere utile nella diagnosi di neurosifilide e quando altri test sierologici sono incoerenti.

RIBT diventa positivo molto più tardi di RIF e RV. Pertanto, non viene utilizzato per diagnosticare forme infettive di sifilide.

RIBT, come RIF, è molto lentamente negativo nel processo di terapia antisifilitica. Di conseguenza, non è adatto per monitorare l'andamento della terapia antisifilitica.

I risultati falsi positivi (FPR) nella RIBT sono rari e sono stati osservati principalmente in un certo numero di treponematosi (framboesia, pinta, bejel), che non si trovano in Russia, così come nella lebbra, sarcoidosi, LES, tubercolosi, cirrosi di il fegato e alcune altre malattie rare di natura non sifilitica. Con l'età dei pazienti, aumenta il numero di risultati falsi positivi di RIBT.

La RIBT può risultare falsamente positiva se il siero del test contiene sostanze treponemicide (ad esempio penicilline, tetracicline, eritromicina) che causano l'immobilizzazione aspecifica del treponema pallido.Ciò può essere dovuto al fatto che il paziente assume antibiotici treponemocidi, pertanto l'esame non è effettuato in persone che hanno ricevuto antibiotici nell'ultimo mese. Il sangue per RIBT può essere esaminato non prima di 2 settimane dopo la fine degli antibiotici e di altri farmaci antisifilitici.

9. Modificazioni della reazione di immobilizzazione dei treponemi pallidi

Oltre alla tecnica microanaerostatica, esiste un'impostazione melange di RIBT secondo N.M. Ovchinnikov. Le condizioni anaerobiche durante la formulazione della reazione vengono create ponendo la miscela di reazione in un melanger (miscelatore di leucociti), le cui due estremità sono chiuse con un anello di gomma. La tecnica della reazione melange consente di fare a meno di una pompa a vuoto, di un cilindro con una miscela di azoto e anidride carbonica e di un microanaerostato. In uno studio comparativo su un ampio materiale clinico, sono stati ottenuti risultati non inferiori alla classica tecnica anaerostatica.

10. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi di RIBT

RIBT è un metodo diagnostico tecnicamente complesso e costoso. La tecnologia richiede fondi significativi per il mantenimento dei conigli e per i test. Questo test che richiede tempo è attualmente utilizzato principalmente per scopi scientifici. Nella maggior parte dei paesi stranieri, per quasi 40 anni, il RIBT è stato praticamente utilizzato non per scopi diagnostici, ma solo per lavori di ricerca.

Svantaggi di reazione:

• RIBT richiede lavoro con treponema pallidum patogeno vivo del ceppo Nichols, che rimane contagioso per l'uomo nonostante l'adattamento ai conigli
• la reazione è complessa, lunga e costosa
• è necessario un vivaio
• è richiesto personale altamente qualificato per allestire la reazione, registrare i risultati e mantenere il vivaio
• soggettività della valutazione dei risultati
• mancanza di automazione
• non c'è modo di standardizzare questo metodo sierologico.
• la reazione non è applicabile sullo sfondo della terapia antisifilitica in corso
• incapacità di utilizzare per controllare la cura. La RIBT nei pazienti con sifilide può rimanere positiva per molti anni (e anche per tutta la vita), nonostante il trattamento completo ricevuto.
• la reazione può dare risultati falsi positivi in ​​pazienti con tumori maligni, diabete, lebbra, malattie autoimmuni, polmonite, grave patologia cardiovascolare.

I vantaggi di RIBT sono:

1) Sensibilità sufficientemente elevata;

2) Elevata specificità.

RIF (reazione di immunofluorescenza)

La reazione di immunofluorescenza (RIF) è un metodo diagnostico rapido per rilevare antigeni microbici o rilevare anticorpi. I test basati sulla rilevazione di un segnale fluorescente sono considerati tra i migliori test per la sifilide.

1. Storia del metodo

L'anticorpo treponemico fluorescente (FTA) è stato sviluppato per la prima volta nel 1957 da Deacon e altri (Deacon, Falcone e Harris).

2. Il principio del metodo

Il metodo RIF si basa sul fatto che gli antigeni tissutali oi microbi trattati con sieri immuni con anticorpi marcati con fluorocromi possono brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza. I batteri in uno striscio, trattati con un siero così luminescente, brillano lungo la periferia della cellula sotto forma di un bordo verde

Come antigene in RIF, viene utilizzata una sospensione di treponemi pallidi patogeni vivi del ceppo Nichols dell'orchite di coniglio, che viene essiccata su un vetrino e fissata con acetone. Il siero del sangue del paziente viene aggiunto ai pallidi treponemi essiccati e fissati con acetone al bicchiere.

Dopo il lavaggio, la preparazione viene trattata con siero contenente anticorpi contro le immunoglobuline umane marcate con fluoresceina. Ancora una volta, la preparazione viene lavata e osservata al microscopio a fluorescenza. Se il siero del test contiene anticorpi anti-treponemici alla fluoresceina, si noterà un bagliore giallo-verde dei treponemi.

3. Il metodo di conduzione della ricerca con il metodo RIF

L'antigene fissato sul vetrino (treponema pallidum patogeno) viene elaborato dal siero del test. Dopo il lavaggio, la preparazione viene trattata con siero fluorescente anti-immunoglobulina umana marcato con fluorocromo. In questo caso, il risultante complesso fluorescente (globulina anti-umana + tioisocianato di fluoresceina) si lega alla globulina umana sulla superficie del treponema pallido, fornendo un bagliore di treponema pallido sotto un microscopio a fluorescenza.

Per rilevare i complessi antigene-anticorpo, viene utilizzato siero luminescente, che rappresenta immunoglobuline anti-specie (anti-umane) coniugate con FITC. La presenza di anticorpi contro i treponemi nel siero è determinata dal bagliore dei treponemi quando esaminati al microscopio a fluorescenza. Il test viene eseguito in versione qualitativa e semiquantitativa.

4. Contabilizzazione dei risultati

La visualizzazione dei risultati RIF viene effettuata utilizzando un microscopio a fluorescenza. I risultati sono valutati dal grado di luminescenza dei treponemi nella preparazione. In presenza di anticorpi, è visibile il bagliore dei treponemi, ma se non ci fossero anticorpi antitreponemici nel siero, i treponemi non sono visibili. Il grado di luminescenza del treponema pallido essiccato fissato al vetro è indicato in “più” (da “–” a “++++”). Risultato negativo - nessun bagliore o livello di sfondo - 1+.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare

La reazione di immunofluorescenza (RIF) è abbastanza sensibile in tutte le fasi dell'infezione, dalla fine del periodo di incubazione alla sifilide tardiva. Il periodo primario della sifilide nel decorso classico inizia 3-4 settimane dopo l'infezione. RIF diventa positivo nei primi giorni del periodo primario o anche alla fine del periodo di incubazione, dalla 3a settimana dopo l'infezione. I risultati del RIF rimangono positivi in ​​tutti i periodi, anche nelle forme tardive.

RIF diventa positivo un po' prima di RW. Secondo alcuni rapporti, la RIF positiva si verifica nell'80% dei pazienti con sifilide sieronegativa primaria. Nel periodo secondario, RIF è positivo in quasi il 100% dei casi. È sempre positivo nella sifilide latente e dà risultati positivi del 95-100% nelle forme tardive della malattia e nella sifilide congenita.

6. Sensibilità e specificità

La reazione di immunofluorescenza (RIF) è un gruppo di metodi con elevata sensibilità e specificità. RIF è sensibile in tutte le fasi dell'infezione, dal periodo di incubazione alla sifilide tardiva. Secondo l'OMS, la sensibilità del RIF nella sifilide primaria è del 70-100%, nella sifilide secondaria e tardiva - 96-100%, specificità - 94-100%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità della RIF in tutte le forme di sifilide è del 99,1%.

La specificità di RIF può essere aumentata pretrattando il siero del test con un antigene treponemico adsorbente ultrasonificato che lega gli anticorpi di gruppo (RIF-abs).

7. Ambito del metodo

RIF si applica:

• come reazione di conferma nella sifilide precoce e latente
• per la diagnosi retrospettiva
• per differenziazione delle forme latenti di sifilide e risultati falsi positivi di ricerche su sifilide.
• come test di conferma per la neurosifilide.

RIF è ampiamente utilizzato come test di conferma, ma non è destinato all'uso di routine o allo screening perché è tecnicamente difficile da configurare. Per eseguire la RIF è necessario disporre di un vivaio o acquistare una sospensione di treponemi pallidi patogeni, che limita la possibilità di una reazione. Tuttavia, negli ultimi anni, sul mercato interno hanno iniziato ad apparire sistemi di test che consentono di eseguire la reazione in assenza di un vivaio e di un proprio ceppo di laboratorio di treponema pallidum patogeno.

8. Fonti e cause di errori di messa in scena, falsi positivi e falsi negativi

LPR quando si imposta RIF sono rari (con collagenosi, borreliosi).

Il RIF è ancora considerato uno dei migliori test per la sifilide, il "gold standard" della sierodiagnosi. RIF rispetto a RIBT è più facile da configurare,

Nonostante l'alto valore diagnostico, la necessità di utilizzare T. pallidum vivo, l'alto costo e la durata dello studio ostacolano l'introduzione diffusa della RIF nella pratica quotidiana. Impostare la reazione è laborioso. Inoltre, la valutazione dei risultati del RIF è soggettiva.

Vantaggi del RIF e RIBT sono:

1) Alta sensibilità (soprattutto per RIF);

2) Elevata specificità (soprattutto per RIBT).

Svantaggi di RIF e RIBT:

1) Complessità tecnica, alto costo dei metodi.

2) Valutazione soggettiva dei risultati, mancanza di automazione;

3) RIF e RIBT nei pazienti con sifilide possono rimanere positivi per molti anni (e anche per tutta la vita), nonostante il trattamento completo ricevuto. Pertanto, queste reazioni non possono essere utilizzate per controllare la cura.

10. Modifiche al metodo

In pratica, per la sierodiagnosi della sifilide, vengono utilizzate e sono state utilizzate diverse modifiche della reazione di immunofluorescenza:

• RIF-ass- il metodo più sensibile di sierodiagnosi della sifilide, diventa positivo prima di altre reazioni (dalla 3a settimana dall'infezione);
• RIF-200(il siero del paziente viene diluito 200 volte al momento della presentazione) è un metodo altamente specifico per la sierodiagnosi della sifilide.
• RIF-10(10 volte diluizione del siero di prova) - un metodo più sensibile rispetto a RIF-200.
• RIF-ts effettuata con liquore.
• RIF-abs-IgM- rilevazione di anticorpi antitreponemici precoci della classe IgM.

1. La modifica più diffusa RIF-ass- reazione di immunofluorescenza con assorbimento. Prima di impostare la reazione, il siero del soggetto viene impoverito con una miscela di treponemi non patogeni per escludere reazioni incrociate. Gli anticorpi di gruppo vengono rimossi dal siero studiato utilizzando treponemi culturali distrutti dagli ultrasuoni, il che aumenta significativamente la specificità della reazione. Poiché il siero del test viene utilizzato in una diluizione 1:5, RIF-abs è altamente sensibile.

Le principali indicazioni per l'uso di RIF-abs nella pratica clinica sono:

• diagnosi di forme latenti e tardive di sifilide,
• rilevamento di risultati falsi positivi di CSR e RMP, specialmente in pazienti in gravidanza e somatici con sospetta sifilide,
• stabilire una diagnosi retrospettiva della malattia.

RIF-abs non è molto istruttivo nella valutazione dei risultati del trattamento: nell'85% dei pazienti che hanno ricevuto un'adeguata terapia antisifilitica, i risultati positivi di RIF persistono per molti anni.

Questa reazione è chiamata "gold standard" per la sierodiagnosi della sifilide. Viene utilizzato per i casi di arbitrato, ma per un risultato affidabile è necessaria una sospensione fresca concentrata di T. pallidum ceppo Nichols da orchite di 7 giorni in un coniglio, che non deve essere congelata.

2. In URSS è stato installato in due versioni: RIF-10 E RIF-200, cioè con una diluizione del siero in esame di 10 e 200 volte. RIF-200 - il siero del test viene diluito 200 volte per ridurre il numero di risultati falsi positivi. Ciò fornisce un'elevata specificità della reazione, ma la sua sensibilità diminuisce leggermente. RIF-10 è più sensibile, ma più spesso dà risultati positivi non specifici, rispetto a RIF-200, che è caratterizzato da un'elevata specificità. RIF-10 è più sensibile, RIF-200 e RIF-abs sono più specifici.

La sensibilità di RIF-200 e RIF-abs è stimata all'84-99% e la specificità è del 97-99%.

3. RIF-ts effettuata con liquore. La reazione viene impostata utilizzando l'intero liquido cerebrospinale per identificare specifiche lesioni del SNC.

4. Reazione RIF-abs-IgM proposto per la rilevazione di anticorpi antitreponemici precoci della classe IgM. Questa reazione può essere utilizzata per diagnosticare la sifilide congenita, le prime forme di sifilide e diagnosi differenziale casi di reinfezione e sierorecidiva.

Sono note due modifiche di questa reazione:

– FTA-ABS-IgM, basato sull'utilizzo di un coniugato anti-IgM (anticorpi anti-IgM umani marcati con fluoresceina) nella seconda fase della reazione al posto della globulina fluorescente anti-umana;

- la versione russa di RIF-abs-IgM, caratterizzata dal fatto che al siero del sangue del test viene aggiunto un assorbente, rimuovendo gli anticorpi IgG, e RIF-abs viene posto con i restanti anticorpi IgM.

Principali indicazioni alla formulazione di RIF-abs-IgM sono:

- sierodiagnosi di sifilide congenita in assenza di manifestazioni manifeste di sifilide congenita sulla cute e sulle mucose del bambino;

- diagnosi differenziale di reinfezione e recidiva clinico-sierologica o sierologica della sifilide, in cui RIF-abs-IgM sarà negativo e RIF-abs - positivo;

- valutazione dell'efficacia della terapia per la sifilide precoce acquisita o congenita: dopo trattamento adeguato, RIF-abs-IgM diventa negativo entro i successivi 3-6 mesi.

Questa reazione può essere utilizzata per rilevare la sifilide congenita. È noto che le grandi molecole di IgM non possono passare attraverso una placenta sana. Pertanto, gli anticorpi di classe M contro il treponema pallidum possono comparire nel corpo del bambino a causa di una violazione della funzione barriera della placenta, oppure sono prodotti dal corpo di un bambino con la sifilide. Gli anticorpi della classe IgM compaiono nel sangue di un paziente con sifilide già nelle prime settimane della malattia e gli anticorpi classe IgG apparire più tardi. La determinazione separata degli anticorpi di entrambe le classi è estremamente utile nella diagnosi della sifilide congenita nei bambini, poiché la presenza di anticorpi di classe IgM in un bambino nel primo mese di vita indicherà che sono formati dal corpo di un bambino con la sifilide, mentre il rilevamento dei soli anticorpi IgG indicherà la provenienza materna di questi ultimi.

Dichiarazione della reazione 19S(IgM)-RIF-ass comporta la separazione preliminare mediante filtrazione su gel di molecole IgM 19S più grandi da

frazioni di molecole 7S IgG più piccole. Ulteriori studi sulla reazione RIF-abs del siero sanguigno contenente solo la frazione 19S IgM,

elimina tutte le possibili fonti di errore. Ma la tecnica per impostare questa reazione è complessa e richiede tempo, richiede attrezzature speciali e formazione di specialisti.

Reazione di immunoadesione (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Questa reazione si basa sull'uso di un fenomeno descritto da Rieckenberg nel 1912. RIP si basa sul fatto che i treponemi tissutali virulenti, sensibilizzati dal siero di un paziente affetto da sifilide, aderiscono alla superficie degli eritrociti in presenza di complemento ed eritrociti e, durante la centrifugazione, vengono portati via con essi nel sedimento, scomparendo dal il surnatante.

Per allestire la reazione vengono utilizzati i seguenti ingredienti: siero del test, antigene, complemento, eritrociti del donatore, soluzione isotonica di cloruro di sodio. Come antigene viene utilizzata una sospensione di treponema pallido del ceppo Nichols.

Più ampiamente in relazione alla sierodiagnosi della sifilide, questo test è stato studiato da autori nazionali e stranieri negli anni '50 e '60. I dati sul valore del RIP come test diagnostico sono stati contrastanti. La reazione richiedeva la massima accuratezza, poiché con il versamento impreciso degli ingredienti, con un eccesso o una carenza del materiale di prova nella preparazione, si ottenevano risultati inaffidabili.

In Russia, L.V. Sazonova, che ha ottenuto risultati simili in RIP e RIT utilizzando una sospensione appena preparata di treponemi pallidi patogeni del ceppo Nichols. Tuttavia, l'uso di un antigene riscaldato o conservato con fenolo alterava nettamente i risultati della reazione e rendeva instabile l'antigene. Consiglia questo test per sostituire RIT L.V. Sazonova lo considerava impossibile.

GP Avdeeva, utilizzando altri regimi di temperatura e tempo nella preparazione dell'antigene, ha ottenuto risultati diversi nello studio del RIP. Secondo lei, la sensibilità di questa reazione è superiore alla sensibilità di KCP e RIT, ma leggermente inferiore a RIF, e la specificità di RIP, RIT e RIF è vicina.

Tuttavia, il mancato rilascio in produzione dell'antigene per RIP non ha consentito uno studio più ampio di questo test e la sua introduzione nella pratica.

Reazione RPHA di emoagglutinazione passiva

Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA)è un test sierologico comune che è saldamente radicato nella pratica di laboratorio. ha un livello abbastanza alto di efficienza nello studio.

1. Storia del metodo RPGA

Per la prima volta, G.Blumental e W.Bachman (1932) riferirono sull'uso di RPHA per la diagnosi della sifilide. Nel 1965 fu proposta una reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva per la diagnosi di sifilide. La modifica della reazione utilizzando diversi antigeni è stata segnalata da T. Ratlev nel 1965-1967. La micromodificazione di RPGA è stata proposta da Sokh R.M. e coautori nel 1969. Il primo sistema di test commerciale è stato sviluppato dagli scienziati giapponesi Tomisava et. al. nel 1969

2. Principio del metodo RPHA

Da una sospensione omogenea preparata di eritrociti "caricata" di antigeni, quando viene aggiunto il siero in esame contenente anticorpi, precipita un precipitato sotto forma di scaglie. Il precipitato risultante è costituito da eritrociti "incollati" da anticorpi e viene chiamato "emoagglutinato". Una sospensione di eritrociti viene preparata in anticipo e fornita come parte dei sistemi di test diagnostici.

Il processo di incollaggio dei globuli rossi, sulla cui superficie sono presenti gli antigeni, è chiamato "emoagglutinazione". Il legame avviene sotto l'azione di anticorpi specifici (agglutinine). La reazione è chiamata "passivo", Perché i propri antigeni degli eritrociti non reagiscono e gli eritrociti stessi svolgono una funzione di indicatore esclusivamente ausiliaria.

La reazione di emoagglutinazione passiva (indiretta) è un tipo di reazione di agglutinazione in cui gli eritrociti (dal greco háima - sangue) sono usati come portatori di antigeni e non altre particelle. In generale, nella reazione di agglutinazione sotto l'azione di anticorpi, microbi o altre cellule si uniscono e precipitano - non necessariamente eritrociti, ma, ad esempio, particelle di lattice, batteri o altre particelle corpuscolari portatrici di antigeni.

Nella reazione di emoagglutinazione passiva per la diagnosi di sifilide, vengono utilizzati come antigeni eritrociti di ariete o di uccello rivestiti con antigeni di treponema pallido. Quando si aggiunge siero contenente anticorpi specifici, gli eritrociti si uniscono (agglutinazione).

La reazione di RPHA è indicata come metodi immunologici, perché. si basa sull'interazione specifica dell'antigene del treponema pallidum patogeno con un anticorpo. Secondo la "teoria del reticolo", l'agglutinazione è il risultato della "reticolazione" di molecole di antigene di superficie con molecole di anticorpi (immunoglobuline).

3. Dichiarazione della reazione di emoagglutinazione passiva

L'RPHA viene posto in compresse di plastica o in provette con diluizioni del siero del sangue del paziente, a cui viene aggiunto un diagnostico eritrocitario.

Il processo di combinazione di un antigene con gli eritrociti è chiamato sensibilizzazione e l'antigene corpuscolare artificiale ottenuto in questo modo è chiamato eritrociti sensibilizzati. I diagnostici eritrocitari sono chiamati eritrociti sensibilizzati da un antigene.

Per la preparazione del diagnostico si utilizzano eritrociti di montone o di uccello (solitamente pollo) trattati prima con formalina e poi con tannino, che vengono sensibilizzati con l'antigene ecografico del treponema pallidum patogeno (ceppo Nichols) o con proteine ​​ricombinanti del treponema pallidum (TpN15, TpN17, TpN47). Possono essere utilizzati anche eritrociti di pecora sensibilizzati con antigene ultrasonificato di treponema pallidum in coltura.

Solo siero (non usare plasma). I campioni emolizzati e torbidi non sono adatti. Gli eritrociti non sensibilizzati fungono da controllo negativo (per escludere la presenza di anticorpi anti-eritrociti). In ogni serie di produzioni utilizzare controlli positivi e negativi.

Campioni del siero del sangue studiato e degli eritrociti di prova vengono introdotti nei pozzetti (cellule) della compressa immunologica. Se il siero del sangue del paziente contiene anticorpi anti-treponemici specifici, quando il siero del test viene aggiunto al pozzetto con l'antigene, si formano complessi antigene-anticorpo associati alla superficie dei portatori (eritrociti). Visivamente, questo si manifesta con l'incollaggio dei globuli rossi, cioè l'emoagglutinazione, che è visibile ad occhio nudo. Gli immunocomplessi "anticorpo-antigene-eritrocita", che scendono gradualmente sotto l'influenza della gravità, sono distribuiti su tutta la superficie del fondo del pozzetto e formano un'immagine caratteristica di un "ombrello rovesciato".

A seconda della quantità di anticorpi contenuti nel campione in esame, l'immagine “ad ombrello rovesciato” varia dal massimo, che occupa l'intera superficie del fondo del pozzetto, ad una piccola area nella parte centrale più bassa di esso (con illuminazione in centro e la formazione di un anello più intenso di eritrociti sedimentati lungo la periferia).

Gli immunocomplessi non si formano se non ci sono anticorpi specifici nel campione o quando alla reazione vengono aggiunti eritrociti di controllo (intatti). Allo stesso tempo, gli eritrociti si raccolgono gradualmente nel punto più basso del fondo del pozzo, formando una figura a forma di macchia compatta o "bottone", talvolta con una leggera illuminazione al centro.

Se il siero del sangue umano contiene anticorpi anti-eritrociti, si formerà comunque l '"ombrello", sia in reazione con gli eritrociti di prova che con gli eritrociti di controllo. In questo caso, si raccomandano altre tecnologie mediche per rilevare specifici anticorpi antitreponemici.

È possibile il fenomeno della prozona (l'impossibilità di reazione per eccesso di anticorpi), che viene eliminata per diluizione del siero.

4. Considerazione dei risultati della reazione di emoagglutinazione passiva

I risultati di RPGA vengono presi in considerazione visivamente dopo 60-120 minuti quando si imposta il micrometodo e dopo 2-4 ore o il giorno successivo quando si imposta la macrovariante. Quando si utilizzano eritrociti di uccello più grandi (nucleati), si ottiene un'immagine più chiara e i risultati vengono registrati in una data precedente.

È possibile determinare il titolo (alto titolo TPHA ≥ 1:2 560).

I risultati dello studio sono valutati secondo il sistema 4+ (da "-" a "++++") in base alla dimensione del film formato. Quando si verifica l'agglutinazione, gli eritrociti si trovano sulla superficie del pozzetto sotto forma di un "ombrello" e, con un risultato negativo, gli eritrociti scivolano liberamente verso il basso e si accumulano sul fondo al centro del pozzetto sotto forma di "bottone ".

La valutazione generalmente accettata dei risultati di RPGA:

4+ - RPHA positivo. Gli eritrociti agglutinati a forma di "ombrello" rivestono uniformemente l'intera superficie del foro;

3+ - RPHA positivo. Gli eritrociti rivestono l'intera superficie del foro, ma alcuni di essi "scivolano" verso il centro. Allo stesso tempo, lungo la periferia del deposito si forma un anello evidente;

2+ - RPHA debolmente positivo. Gli eritrociti formano un film su una piccola area della parte inferiore del pozzo, formando un denso anello di sedimento eritrocitario con una notevole illuminazione al centro;

1+ - RPHA indeterminato, gli eritrociti formano un sedimento sciolto sul fondo del pozzetto con bordi sfocati e un leggero lume al centro;

(–) - RPHA negativo, tutti gli eritrociti giacciono sul fondo del pozzetto sotto forma di un sedimento compatto ("bottoni" o riccioli) su uno sfondo circostante pulito (senza sedimentazione granulare circostante).

Nella pratica straniera, i risultati dell'RPGA sono anche valutati come reattivi (nel caso di formazione di agglutinati), debolmente reattivi (se le formazioni sono insignificanti) e non reattivi (se non si osserva agglutinazione).

La contabilizzazione dei risultati della reazione può essere eseguita automaticamente utilizzando analizzatori speciali. Oltre a uno studio qualitativo, tutti i sistemi di test prevedono un'analisi quantitativa con determinazione del titolo.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare RPHA

RPHA diventa positivo nel mezzo del periodo primario (7-8 settimane dal momento dell'infezione, 3-4 settimane dopo la comparsa di un'ulcera dura) e rimane positivo per anni dopo il trattamento.

Con un livello molto elevato di anticorpi contro il treponema nel siero studiato (che è il più caratteristico della sifilide secondaria), è possibile un risultato falso negativo di TPHA (il cosiddetto fenomeno "prozona").

Anticorpi specifici per l'agglutinina vengono rilevati nel sangue di persone che hanno avuto la sifilide da molto tempo, quindi l'RPGA non può essere raccomandato per la diagnosi differenziale della reinfezione o per determinare la gravità del processo infettivo.

RPGA non viene utilizzato per controllare la cura, perché. può rimanere positivo molti anni dopo il recupero. Allo stesso tempo, può essere utilizzato come metodo aggiuntivo (a RMP o RPR) per monitorare l'efficacia del trattamento, indagando la dinamica della diminuzione dei titoli anticorpali. Un prerequisito per questo è l'uso dello stesso sistema di test RPGA del primo esame (prima del trattamento) del paziente, nonché lo studio nello stesso laboratorio.

6. Sensibilità e specificità di RPHA

RPHA è considerato un test altamente sensibile e specifico. Questa reazione è un prezioso test diagnostico in tutte le forme di sifilide, ma è particolarmente sensibile nelle forme avanzate della malattia. La sensibilità di RPHA varia a seconda dello stadio della malattia. Con la sifilide primaria, la sensibilità dell'RPHA è del 76% (e superiore), con la sifilide secondaria - fino al 100%. Con latente precoce - 97%, con sifilide tardiva - 94%, con una specificità del 98-100%. La minore sensibilità nelle forme fresche della malattia è dovuta alla successiva formazione di agglutinine.

Secondo l'istituzione statale "TsNIKVI Roszdrav", la sensibilità dell'RPHA nella diagnosi di varie forme di sifilide era del 99,4%. La maggior parte dei ricercatori nota una specificità del 98-99% di RPHA.

In termini di sensibilità e specificità, RPHA non è inferiore e nelle forme tardive e nella sifilide congenita supera addirittura RIF e RIBT.

7. Ambito di applicazione del metodo RPGA

Il TPHA può essere utilizzato sia come test di screening che di conferma; può essere utilizzato in variante semiquantitativa con il calcolo del titolo anticorpale. Sono stati sviluppati un metodo quantitativo per la creazione di RPHA, un micrometodo e una reazione di microemoagglutinazione automatizzata.

8. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi di RPGA

Secondo la letteratura, RPGA ha costantemente assunto una posizione di leadership nella pratica clinica nella maggior parte dei paesi del mondo. Il TPHA è il test più utilizzato nelle cliniche STI all'estero.

La tecnica RPGA è facile da eseguire, non richiede attrezzature speciali: è necessaria solo una piastra di emoagglutinazione per allestirla. Lo studio non richiede molto tempo; la reazione è altamente sensibile e specifica. L'approvazione del metodo nella pratica clinica ha dimostrato che è estremamente semplice, economico e sensibile. Come ELISA, RPHA è semplice da eseguire, non richiede personale altamente qualificato e attrezzature speciali e la sua automazione è possibile.

Vantaggi del test RPGA:

• facile da configurare e interpretare,
• non richiede attrezzature speciali,
• tempo per ottenere il risultato - 45 minuti,
• adatto per lo screening di massa (sono necessari solo 25 µl di siero a una diluizione di 1:20),
• alto grado di standardizzazione,
• la presenza di controlli interni,
• lunga durata
• prezzo accettabile
• la possibilità di automatizzare la contabilità.

Va anche notato gli svantaggi di RPGA:

• la possibilità di reazioni non specifiche in presenza di anticorpi anti-eritrociti,
• mancanza di correlazione tra titolo e stadio della sifilide,
• successiva reazione positiva nelle prime fasi della sifilide,
• la possibilità di reazioni false positive in persone che hanno assunto alcol, tossicodipendenti,
• sensibilità alle vibrazioni e alla temperatura in laboratorio.

I vantaggi di RPGA rispetto a RIBT e RIF sono:

• utilizzo di sistemi di test industriali,
• la possibilità di automatizzare la reazione,
• non è necessario lavorare con treponema pallido vivo,
• elimina la necessità di un vivaio.

9. Fonti e cause di errori nell'impostazione di RPHA, risultati falsi positivi e falsi negativi

La reazione dell'emoagglutinazione passiva è uno studio relativamente semplice; quando lo si esegue, è necessario seguire tutte le raccomandazioni dei produttori diagnostici e le regole di lavoro nel laboratorio diagnostico clinico. Gli errori commessi possono portare alla comparsa e alla registrazione di risultati sia falsi negativi che falsi positivi della reazione. I risultati falsi positivi di RPGA possono essere dovuti all'influenza del fattore umano e di fattori biologici.

Si possono ottenere risultati falsi positivi

• nello studio dei sieri di sangue di pazienti con treponematosi non veneree,
• a causa del fattore reumatoide
• a causa di anticorpi che reagiscono in modo incrociato con l'antigene treponemico, che si formano durante vari disturbi metabolici sistemici o indotti da farmaci e indotti da farmaci,
• a causa di livelli anormali di immunoglobuline;
• nei neonati - a causa della formazione nel corpo del feto o del bambino di anticorpi IgM contro l'IgG della madre, che complica l'interpretazione dei risultati e la diagnosi della sifilide congenita.

Errori causati dall'influenza del fattore della partecipazione umana sullo studio:

• micropiastre contaminate
• pipettaggio errato
• vibrazioni in laboratorio
• la temperatura dell'aria nel laboratorio è al di fuori dell'intervallo di temperatura: 18–25 gradi

Gli errori tecnici più tipici nell'impostazione di RPGA, che portano a risultati inaffidabili, includono:

• diluizione imprecisa degli ingredienti,
• violazione regime di temperatura,
• violazione del tempo di incubazione dei reagenti,
• violazione dei termini di applicazione dei reagenti al tablet,
• incoerenza del pH delle soluzioni con quelli richiesti,
• contaminazione della vetreria di laboratorio.

Anche i seguenti punti tecnici possono essere fonte di errori durante l'impostazione di RPGA:

• esclusione dalla formulazione della reazione dei sieri di sangue di controllo;
• concentrazione irregolare di eritrociti nel diagnostico a causa di una miscelazione insufficiente prima dell'uso;
• violazione dei termini e delle condizioni di conservazione del diagnostico e degli eritrociti di controllo; utilizzo di kit scaduti;
• l'uso di provette contaminate, punte di pipette, pipette, piastre immunologiche, soluzioni durante l'impostazione delle reazioni;
• imprecisioni nella diluizione iniziale di un campione di siero sanguigno;
• completezza insufficiente nell'eseguire doppie diluizioni consecutive;
• inosservanza del regime di temperatura e del tempo di incubazione;
• la presenza di vibrazioni estranee e scuotimento della piastra immunologica durante l'incubazione;
• violazione del metodo di impostazione RPGA, espressa nel rifiuto di eseguire lo studio con eritrociti di controllo.

L'uso di plasma sanguigno contenente anticoagulanti in grado di provocare l'agglutinazione eritrocitaria aspecifica (RPHA) può portare a risultati non interpretabili.

Il numero di risultati falsi positivi e falsi negativi è inferiore rispetto ad altri test sierologici. LPR nel contesto di RPHA sono rari e possibili con treponematosi (framboesia, bejel, pinta). Inoltre, sono stati registrati risultati falsi positivi (meno dell'1% in totale) nei tossicodipendenti, nei pazienti con mononucleosi infettiva, borreliosi, lebbra, con collagenosi, cirrosi epatica, linfosarcoma e anche nelle donne in gravidanza.

I risultati falsi negativi della reazione possono essere dovuti alla competizione tra anticorpi IgM e IgG. Risultati falsi negativi sono possibili anche nei pazienti con infezione da HIV.

10. Modifiche del metodo RPHA

Ci sono modifiche micro e macro dell'impostazione RPGA, la prima è più spesso utilizzata a causa dell'economia, della velocità di impostazione e tenendo conto dei risultati.

Inoltre, un automatico complesso diagnostico analisi dell'immagine, che ha permesso di effettuare una valutazione quantitativa automatica dei risultati ed eliminare la soggettività nell'interpretazione dei dati ottenuti. Il complesso hardware-software riconosce l'immagine, elabora i dati e fornisce la risposta in unità relative.

I lettori e gli analizzatori automatici vengono utilizzati anche per automatizzare la registrazione dei risultati RPGA.

TPPA (agglutinazione di particelle Treponema pallidum) - un test di agglutinazione di particelle artificiali per rilevare gli anticorpi contro Treponema pallidum

Breve descrizione del test TPPA

Attualmente, per diagnosticare la sifilide viene utilizzata anche una modifica del metodo di emoagglutinazione passiva - TPRA (agglutinazione di particelle di Treponema pallidum), in cui l'antigene del treponema pallido è fissato su particelle di gelatina. Poiché le particelle di polimero artificiale non hanno i propri antigeni che determinano l'attività biologica, i kit per la sierodiagnosi della sifilide basati su di essi hanno motivo di essere considerati più avanzati. L'uso di particelle artificiali biologicamente inerti riduce al minimo l'agglutinazione non specifica comunemente osservata con altri vettori.

TPPA è utilizzato per la diagnosi sierologica di anticorpi contro vari tipi e sottospecie di treponemi patogeni. Questo test può essere utilizzato per rilevare gli anticorpi contro gli agenti causali di sifilide, pinta, bejel e framboesia.

La procedura di studio è molto semplice e non richiede attrezzature speciali: vengono utilizzate micropiastre standard a forma di "U". Il test si basa sull'agglutinazione di particelle di gelatina sensibilizzate con antigeni di T. pallidum, anticorpi presenti nel siero del sangue del paziente.

TPPA è un test treponemico di conferma che può essere utilizzato convenientemente sia per piccoli numeri di campioni che per lo screening di massa. Il TPPA viene utilizzato all'estero come test di conferma e in sostituzione del test di microemoagglutinazione MHA-TP (test di microemoagglutinazione per anticorpi contro T. pallidum).

La sensibilità del test TPPA è compresa tra l'85% e il 100%, mentre la specificità è compresa tra il 98% e il 100%. La sensibilità del TPPA per la sifilide primaria è dell'88%, per la sifilide secondaria e latente tardiva del 98%-100%.

Se il TPPA viene utilizzato per diagnosticare la sifilide, gli anticorpi contro altri tipi di treponema (come T. pallidum endemicum, pertenue o carateum) possono causare risultati falsi positivi. Esistono diversi metodi per rimuovere questi anticorpi dai campioni di siero prima di iniziare il test.

Principio del test TPPA

TPPA è un metodo di agglutinazione passiva per particelle di gelatina nel siero o plasma umano. Il siero contenente anticorpi contro il treponema patogeno reagisce con particelle di gelatina sensibilizzate con l'antigene del treponema pallido del ceppo Nichols, sottoposto ad ultrasuoni. Come risultato della reazione, nel pozzetto della micropiastra si forma una pellicola liscia di particelle di gelatina agglutinate.

Se gli anticorpi non sono presenti, le particelle si depositano sul fondo del pozzetto della piastra, formando un "bottone" compatto di particelle non agglutinate. Anche i pozzetti di controllo con particelle di gelatina non sensibilizzate dovrebbero mostrare un "bottone" così compatto per ogni siero, cioè nessuna agglutinazione.

Applicazione del test TPPA

TPRA è un test universale che può essere utilizzato con uguale successo sia nell'esame preventivo obbligatorio di gruppi di popolazione per la sifilide (screening) sia in istituzioni dermatovenereologiche specializzate. Il vantaggio del test TPPA è la sua elevata sensibilità, che non è inferiore ai test classici, che fino a poco tempo fa erano il "gold standard" per la sierodiagnosi della sifilide. Altri vantaggi del test includono l'elevata riproducibilità, nonché la semplicità e la velocità di impostazione della reazione.

Il test TPPA viene utilizzato per confermare i risultati positivi dei test di screening non treponemici per la sifilide, come il test VDRL, e per valutare i pazienti con test non treponemici negativi ma che presentano segni o sintomi suggestivi di sifilide tardiva. L'uso del TPPA come unico test di screening per la sifilide non è raccomandato.

Inoltre, il test di agglutinazione TPPA può essere utilizzato per esaminare campioni di liquido cerebrospinale nella diagnosi della neurosifilide. In questo caso, come con altri test sierologici, l'interpretazione dei risultati dovrebbe essere effettuata con la combinazione obbligatoria con altri indicatori e sintomi della malattia.

Risultati del test TPPA

Il risultato viene valutato secondo il sistema dei "plus" - da (-) a (2+). I risultati del test sono visibili ad occhio nudo e vengono interpretati come segue:

Grado di agglutinazione	Punteggio del test	Interpretazione
Le particelle agglutinate rivestono uniformemente il fondo della piastra	2+	Positivo
Grande anello significativo con margini esterni irregolari e agglutinazione periferica	1+	Positivo
Le particelle formano un anello compatto con uno spazio vuoto al centro e liscio liscio confini esterni	±	debolmente positivo
Le particelle formano un anello compatto al centro del pozzetto con un leggero spazio al centro e una superficie liscia confine esterno	–	Negativo
Le particelle formano un "bottone" al centro del foro con un bordo esterno liscio	–	Negativo

I risultati vengono registrati per determinare la conformità con la descrizione di cui sopra. I campioni che mostrano un risultato indeterminato (±) devono essere ritestati. Nel caso in cui un campione mostri un risultato indeterminato in diversi test TPPA, si consiglia di condurre uno studio utilizzando altri metodi.

I risultati dell'analisi non devono essere considerati isolatamente. Ad esempio, in una fase iniziale dell'infezione, il numero di anticorpi è ancora troppo piccolo, per cui il TPPA e molti altri metodi mancano di sensibilità. Pertanto, se si sospetta la sifilide, anche se i risultati del test sono negativi, i campioni devono essere riesaminati. Per fare una diagnosi, è necessario tenere conto dei sintomi clinici che ha il paziente, della storia clinica e di altri dati.

Come nel test TPHA, è possibile osservare il fenomeno della prozona e un risultato falso negativo per TPPA se il campione di siero contiene un titolo anticorpale troppo elevato.

ELISA - ELISA

Il test immunoenzimatico (ELISA; The enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) è uno dei tanti metodi per la diagnosi sierologica delle malattie infettive. Il dosaggio immunoenzimatico (ELISA) nella sierodiagnosi della sifilide è un test per gli anticorpi delle classi M, G e A (IgM, IgG, IgA) contro gli antigeni del treponema pallido. È possibile eseguire ELISA con liquido cerebrospinale.

L'introduzione nella pratica del saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) al posto della reazione di Wasserman e di altri test sulla cardiolipina ha migliorato significativamente la qualità diagnostica di laboratorio sifilide. Un vantaggio significativo di questo metodo è la possibilità di automatizzare il processo di ricerca, che riduce l'influenza del fattore umano.

1. Storia del metodo ELISA

I principi di base del dosaggio immunoenzimatico sulla superficie di un vettore in fase solida sono stati sviluppati da E. Engvar et al. (1971), B.Van Weeman e A.Schuurs (1971). Il test immunoenzimatico da loro sviluppato fu proposto per la prima volta per la diagnosi della sifilide nel 1975 da J. Veldkamp e A. Visser, che apprezzarono il potenziale di questo test automatizzato. L'ELISA ha iniziato ad essere ampiamente utilizzato nella diagnosi della sifilide negli anni '80, quando i test diagnostici sono stati sviluppati e certificati e i metodi di analisi sono stati standardizzati. In URSS, la tecnica dell'ELISA per la diagnosi della sifilide è stata sviluppata da VN Bednova, AV Babiy e AV Kotrovsky (1982, 1983).

2. Principio del metodo ELISA

Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) secondo il meccanismo di reazione è vicino al RIF (vengono rilevati gli stessi anticorpi). La reazione di immunodosaggio enzimatico è indicata come reazioni immunologiche basato sull'interazione altamente specifica degli antigeni del treponema pallido con gli anticorpi di un paziente affetto da sifilide.

Nella pratica sifilidologica viene utilizzata principalmente una variante indiretta di ELISA. Il principio della variante di reazione indiretta più comunemente usata è il seguente. Sulla superficie dei pozzetti di una piastra di polistirene sono fissati immunocomplessi, che si formano durante l'interazione degli anticorpi di un paziente affetto da sifilide con antigeni di treponema pallido. Successivamente, vengono rilevati in una reazione cromatica utilizzando coniugati specifici e appropriati additivi substrato-cromogeni.

La procedura per eseguire il test è la seguente: il siero del paziente viene posto su un supporto in fase solida con un antigene attaccato ad esso. In presenza di anticorpi in esso, sulla superficie del vettore si forma un complesso antigene-anticorpo. Per "manifestare" i risultati della reazione, vengono utilizzati anticorpi anti-specie per Ig umane coniugati con marcatori enzimatici. In caso di reazione positiva, l'enzima legato al complesso antigene-anticorpo decompone il substrato aggiunto al sistema, determinando lo sviluppo di colorazioni di diversa intensità.

Nella reazione, la determinazione del complesso di AG e AT adsorbiti sulla fase solida viene effettuata utilizzando anticorpi antiglobulina marcati con l'enzima, secondo la reazione cromatica dell'enzima con il substrato.

Nella reazione, la determinazione del complesso di antigeni e anticorpi adsorbiti sulla fase solida viene effettuata utilizzando anticorpi antiglobulina marcati con enzima.

ELISA offre la possibilità di rilevare Ig sieriche di diverse classi. Esistono in commercio sistemi che consentono di determinare separatamente le IgM e le IgG e gli anticorpi totali.

Gli antigeni specifici utilizzati per ELISA possono avere un'origine diversa:

ultra-espresso- sono ottenuti a seguito della distruzione cellula batterica T.pallidum mediante ultrasuoni o altro metodo;

ricombinante- sono ottenuti mediante tecnologie di ingegneria genetica introducendo nel genoma di una cellula batterica (ad esempio, coli E.Coli) il gene responsabile della sintesi di un certo antigene di T.pallidum, seguita dalla crescita della massa batterica del microrganismo produttore, dalla distruzione di queste cellule, dall'isolamento e dalla purificazione dell'antigene;

peptide- ottenuto come risultato della sintesi chimica sequenziale di epitopi antigenici delle proteine ​​​​di T.pallidum.

Il corpo è in grado di formare anticorpi contro quasi ogni parte della molecola dell'antigene. In una normale risposta immunitaria, questo di solito non si verifica. Uno o più peptidi immunogenici isolati da un antigene proteico hanno un'antigenicità speciale e la maggior parte degli anticorpi si forma specificamente per essi. Sviluppano la risposta immunitaria più intensa. Il più informativo in ELISA ha mostrato regioni immunodominanti di proteine ​​​​di treponema pallido con un peso molecolare di 15 kD, 17 kD e 47 kD. Come antigene è stato utilizzato un estratto detergente o sonicato di treponemi patogeni del ceppo Nichols.

3. Il metodo per condurre la ricerca con il metodo

Il principio del metodo consiste nell'identificare uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbito sulla fase solida (la superficie dei pozzetti di una piastra di plastica) con anticorpi antiglobulina marcati con un enzima (perossidasi) utilizzando una reazione cromatica con un substrato, che è quantificato spettrofotometricamente.

Gli antigeni utilizzati per sensibilizzare i pozzetti della piastra in polistirene possono essere:

• lisato- ottenuto a seguito della distruzione del treponema pallido mediante ultrasuoni;
• peptide- ottenuto come risultato della sintesi chimica di frammenti di proteine ​​\u200b\u200bdel treponema pallido e con reattività antigenica simile alle proteine ​​​​originali dell'agente patogeno;
• ricombinante- ottenuto con metodi Ingegneria genetica portatori di determinanti antigenici identici al treponema pallido.

Nella pratica sifilidologica viene solitamente utilizzata una variante indiretta di ELISA.

4. Contabilizzazione dei risultati

In ELISA, per visualizzare la reazione antigene-anticorpo, viene utilizzata una reazione enzimatica (fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano) con un substrato, che cambia colore. L'intensità del colore determina la positività della reazione (da "-" a "++++"). I risultati dell'ELISA possono essere valutati visivamente secondo un sistema a 4 punti o strumentalmente nel modulo indicatori digitali densità ottica ottenuta su appositi lettori (tipo Multiscan) alla lunghezza d'onda di 492 nm. Perché la valutazione dei risultati viene effettuata spettrofotometricamente, ciò esclude interpretazioni soggettive.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare

Termini di positività ELISA - dalla 4a settimana dall'infezione. I risultati dell'ELISA (così come del RIF) diventano positivi nei primi giorni del periodo primario o alla fine dell'incubazione e rimangono positivi in ​​tutti i periodi. L'ELISA è particolarmente utile nella diagnosi precoce della sifilide: i risultati anticorpali positivi possono essere ottenuti già alla fine del periodo di incubazione della malattia (vale a dire, 4-6 settimane dopo l'infezione).

6. Sensibilità e specificità

ELISA è un test altamente sensibile e specifico, che è il suo vantaggio. ELISA in termini di meccanismo di reazione, sensibilità e specificità è vicino a RIF, tk. gli stessi anticorpi prendono parte a entrambe le reazioni. La maggior parte dei ricercatori nota un'elevata specificità e sensibilità in tutte le fasi della malattia. Sensibilità varie opzioni ELISA, secondo G. A. Dmitriev, raggiunge il 98-100% e la specificità - 96-100%. Secondo TsNIKVI, la sensibilità di ELISA per la sifilide è del 99,1% (ordine n. 87 M3 della Federazione Russa).

La variante ELISA in fase solida (test immunoassorbente legato all'enzima, ELISA) è uno dei test sierologici più sensibili, consentendo il rilevamento di 0,0005 µg/ml di anticorpi e 0,000005 µg/ml di antigeni.

7. Ambito del metodo

Si consiglia di utilizzare il metodo durante l'esame di donne incinte, persone di contatto, donatori e rappresentanti di gruppi a rischio. ELISA può essere utilizzato sia come test di screening che di conferma. In un tempo relativamente breve della sua storia, l'ELISA si è evoluto da test indicativo a test di conferma. Nella diagnosi della sifilide, il test viene utilizzato anche come test di conferma per i campioni che mostrano risultati positivi utilizzando vari test non treponemici e TPHA.

Il metodo ELISA può essere utilizzato quantitativamente con il calcolo dell'indice di positività, o reattività, che permette di valutare il livello di anticorpi nel campione.

Attualmente, in Russia, l'uso del dosaggio immunoenzimatico per la diagnosi della sifilide è regolato dall'Ordine del Ministero della Salute della Federazione Russa n. 87 del 26 marzo 2001 "Sul miglioramento della diagnosi sierologica della sifilide" (Appendice n. 1 "Impostazione dei test di screening e diagnostici per la sifilide"). Nell'ordine è prevista la sostituzione di RSK nel complesso delle sieroreazioni (SSR) con ELISA e RPHA.

8. Fonti e cause di errori di messa in scena, falsi positivi e falsi negativi

Il dosaggio immunoenzimatico è un complesso studio in più fasi, in cui è necessario seguire rigorosamente tutte le raccomandazioni dei produttori di kit diagnostici, le regole per la regolazione e la configurazione delle apparecchiature utilizzate nello studio.

I seguenti punti possono essere fonte di errori durante l'impostazione di un ELISA:

Uno studio sulla reazione di siero di sangue iperlipidemico, emolizzato o campioni con segni di crescita batterica;

Non praticare il doppio o più congelamento di un campione di materiale biologico; se necessario, riesame, utilizzare siero da una doppia provetta;

Violazione dei termini e delle condizioni di conservazione dell'immunosorbente e della soluzione di lavaggio; utilizzo di kit di test scaduti;

Applicazione di componenti di reazione da altri kit diagnostici;

Violazione del tempo delle fasi di reazione;

Asciugare i pozzetti della piastra immunologica durante le fasi di reazione;

Riutilizzo di piatti di plastica (vassoi di plastica) per la preparazione di una miscela di cromogeno e substrato;

Mancato rispetto della frequenza del controllo metrologico dei parametri di funzionamento dei dispositivi utilizzati (lavatrice e spettrofotometro);

L'uso di vetreria da laboratorio contaminata durante l'impostazione delle reazioni: matracci, cilindri graduati, provette, pipette, puntali per pipette;

Cura insufficiente nelle diluizioni dei campioni materiale biologico;

Errori durante l'introduzione di un campione di materiale biologico nel pozzetto corrispondente della compressa;

Errori durante il trasferimento dei risultati dello studio al registro di registrazione, al protocollo dello studio o al modulo di risposta.

L'attenta attuazione delle raccomandazioni delle istruzioni per l'uso dei kit di test diagnostici, la verifica regolare dell'accuratezza dei dispensatori di pipette e dei dispositivi automatici, l'uso di controlli interni positivi e negativi consentono di ottenere risultati ELISA altamente riproducibili.

9. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi

ELISA si riferisce a metodi moderni e promettenti di sierodiagnosi della sifilide grazie alla sua semplicità, riproducibilità e disponibilità. La rilevazione degli anticorpi mediante ELISA è un metodo diagnostico ideale adatto per l'esame simultaneo di un gran numero di campioni. Grazie ai suoi vantaggi, ha guadagnato popolarità in tutti i paesi.

La tecnologia della ricerca ELISA prevede il rispetto di tutte le raccomandazioni dei produttori di kit di test diagnostici commerciali e la completezza della procedura di ricerca. Per condurre ricerche nell'ELISA, è necessario acquistare attrezzature speciali aggiuntive. La tecnica di impostazione richiede più tempo rispetto a RMP, RPR e RPGA.

La presenza dell'automazione di più fasi o dell'intero processo nel suo complesso consente di esaminare contemporaneamente un elevato numero di campioni di materiale biologico con un elevato grado di standardizzazione dello studio, riducendo al minimo l'elemento soggettivo nella valutazione dei risultati, il possibilità di memorizzare protocolli di studio fissi, che consente di archiviare i dati dello studio e farvi nuovamente riferimento per l'analisi retrospettiva.

Vantaggi:

• Consente la determinazione differenziata e totale degli anticorpi IgM e IgG contro l'agente eziologico della sifilide.
• alta sensibilità e specificità che si avvicinano al 100%,
• riproducibilità
• possibilità di automazione

I vantaggi dell'ELISA includono l'elevata specificità (96-100%) e la sensibilità (98-100%) notate dalla maggior parte dei ricercatori.

La presenza dell'automazione di più fasi o dell'intero processo nel suo complesso consente di esaminare contemporaneamente un flusso con un numero elevato di campioni di materiale biologico con un elevato grado di standardizzazione dello studio, riducendo al minimo l'elemento soggettivo nella valutazione di risultati, la possibilità di memorizzare protocolli di studio fissi che consentono di archiviare i dati dello studio e farvi nuovamente riferimento per l'analisi retrospettiva .

Svantaggi significativi dei metodi manuali, inclusa la determinazione degli anticorpi contro gli antigeni di T. pallidum mediante ELISA, sono:

~ possibili errori personale durante lo studio (svista, negligenza, violazione della tecnologia);

~ l'impossibilità di una completa standardizzazione del processo di ricerca con una versione manuale dell'ELISA;

~ aumento del rischio di infezione del personale.

10. Modifiche al metodo

Insieme al classico ELISA indiretto, anche il metodo è noto. intrappolare ELISA. È stato proposto nel 1989 da OE Ijsselmudien et al. per rilevare gli anticorpi di classe IgM contro gli antigeni Tr. pallido. Il metodo ha un'elevata specificità e sensibilità.

Gli anticorpi purificati contro le immunoglobuline umane di classe M vengono assorbiti sulla superficie dei pozzetti della compressa e, dopo l'incubazione del siero in esame, tutte le IgM si legano al trasportatore. La presenza tra le IgM associate specifiche per gli antigeni Tr. pallidum viene rilevato utilizzando gli antigeni Tr. pallidum coniugato con un enzima.

Questo metodo consente di rilevare gli anticorpi non solo della classe IgM, ma anche delle classi IgG, IgA. Per fare ciò, i pozzetti delle piastre vengono sensibilizzati con anticorpi purificati per affinità di una certa classe contro le immunoglobuline umane. In questo caso, gli anticorpi di questa classe vengono catturati dal siero e la rilevazione degli anticorpi specifici del treponema viene effettuata combinandoli con un coniugato, che è una combinazione dell'antigene treponemico con un enzima.

L'uso di un ELISA intrappolato riduce il rischio di reazioni false positive mediate dal fattore del sangue reumatoide, reazioni incrociate tra immunoglobuline delle classi M e G. Quando si esaminano i neonati, in questo caso, risultati di test falsi positivi associati alla rilevazione di IgM diretti contro sono escluse anche le IgG antitreponemiche materne.

Poiché le varianti ELISA all'estero sono ampiamente utilizzate test immunitario enzimatico (EIA) e sistema GHIACCIO Sifilide. In quest'ultimo, una miscela di anticorpi IgM e IgG, nonché tre proteine ​​ricombinanti di T. pallidum, è stata adsorbita nei pozzetti della piastra. I risultati positivi vengono testati nello stesso sistema di test in due ripetizioni per fornire il risultato finale.

In Russia sono stati sviluppati numerosi sistemi di test per la sierodiagnosi della sifilide mediante ELISA con reagenti domestici. Questi sistemi hanno un'elevata specificità e sensibilità.

Oltre a quanto sopra, esistono anche altre opzioni ELISA, tra cui quelle che consentono la rilevazione diretta del patogeno nel sangue (ELISA diretto), dot-ELISA con la reazione su strisce di nitrocellulosa, ELISA con sangue capillare, nonché immunoblotting, o Western Blot, con rilevamento simultaneo di anticorpi contro vari componenti dell'agente patogeno.

Una moderna modifica migliorata di ELISA è l'immunoblotting.

ICA (analisi di immunochemiluminescenza), ICL (immunochemiluminescenza)

Con lo sviluppo della diagnostica di laboratorio nel contesto della modernizzazione dell'assistenza sanitaria nella Federazione Russa, l'automazione della ricerca di laboratorio è entrata nella pratica dei laboratori, il che consente di standardizzare le fasi analitiche della ricerca. Ciò migliora la qualità della diagnostica. Con l'introduzione dell'automazione, iniziarono ad essere applicati nuovi metodi ad alta tecnologia con elevata sensibilità e specificità, come l'immunodosaggio a chemiluminescenza (CLIA)

Chemiluminescenza - il processo di emissione di fotoni durante la transizione di prodotti ossidativi eccitati elettronicamente reazioni chimiche tornare al suo stato energetico originario. Durante la reazione di chemiluminescenza, viene rilasciata una quantità significativa di energia e la resa quantica della luce emessa è piuttosto elevata. Di tutti i metodi non isotopici, la chemiluminescenza fornisce la massima sensibilità. Per i metodi immunometrici, la sensibilità della chemiluminescenza è di ordini di grandezza superiore a quella del dosaggio radioimmunologico.

Il metodo dell'immunochemiluminescenza (ICL) ha ora trovato la sua applicazione nella diagnosi di marcatori tumorali, malattie autoimmuni, diabete, marcatori cardiaci, ormoni ( ghiandola tiroidea, ghiandole surrenali, ormoni sessuali femminili e maschili), infezioni da torcia, epatite virale, virus del gruppo herpes.

Sulla base del metodo dell'immunochemiluminescenza, sono stati sviluppati numerosi sistemi di test altamente sensibili e specifici (98-100%) per la diagnosi della sifilide, utilizzati principalmente all'estero.

Nel metodo, le lipoproteine ​​​​ricombinanti ottenute con metodi di ingegneria genetica vengono utilizzate come antigeni, che sono analoghi completi degli antigeni di T.pallidum.

Sulla base dei risultati di uno studio clinico, il metodo ICA è stato riconosciuto e raccomandato per l'uso nella diagnosi di laboratorio della sifilide nella Federazione Russa come screening e test di conferma se i laboratori dispongono dell'attrezzatura appropriata. Nel 2012, l'ICA è stato incluso come test di screening e di conferma per la diagnosi di sifilide nelle linee guida cliniche per la gestione dei pazienti con infezioni sessualmente trasmissibili e infezioni urogenitali.

Pertanto, l'uso dell'ICA ad alta tecnologia, che è entrato nella pratica della diagnostica di laboratorio sia mondiale che domestica con l'introduzione dell'automazione, offre i seguenti vantaggi:

• esclusione dell'influenza di fattori soggettivi nella fase analitica dello studio
• sicurezza del personale durante l'esecuzione di studi su materiale biologico potenzialmente infetto
• aumentare la velocità di ottenimento dei risultati da parte del paziente
• standardizzazione della ricerca e controllo della qualità della ricerca
• consegna di risultati affidabili affidabili ai pazienti
• ricerca clinica di laboratorio di alta qualità.

In termini di sensibilità, il metodo ICA è paragonabile al metodo del dosaggio radioimmunologico, e in termini di facilità di esecuzione, sicurezza per il personale e molti altri parametri, lo supera.

Il metodo ICA, che ha un'elevata sensibilità e specificità (98-100%), consente di quantificare il livello di anticorpi contro l'agente eziologico della sifilide e può essere utilizzato per confermare l'infezione sifilitica e lo screening. Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.

Immunocromatografia (ICH).

Relativamente nuovi per l'uso nella Federazione Russa sono i metodi per rilevare gli anticorpi specifici per il treponema basati sui metodi immunocromatografici (ICH). Come nel metodo ICA, vengono utilizzate come antigeni le lipoproteine ​​ricombinanti ottenute con metodi di ingegneria genetica (ad esempio: antigeni Tp15, Tp17, Tp47) e il peptide biosintetico TmpA. Gli antigeni elencati sono anche usati in varie combinazioni come parte di immunosorbenti in ELISA e immunoblotting.

Il metodo ICG consente di determinare rapidamente il contenuto di anticorpi specifici per il treponema contro l'agente eziologico della sifilide in campioni di siero e sangue intero senza l'uso di speciali apparecchiature di laboratorio e viene utilizzato nella fornitura di assistenza sanitaria primaria, comprese le indicazioni epidemiologiche.

Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.

PBT (test rapidi semplici al letto del paziente)

Relativamente di recente, nella sierodiagnosi della sifilide, ha iniziato a svilupparsi una direzione per lo sviluppo dei cosiddetti test rapidi semplici (PBT), o test al capezzale del paziente (Point-of-care - ROC). Semplici test rapidi al letto del paziente, o test immunocromatografici, consentono di determinare rapidamente il contenuto di anticorpi specifici per il treponema contro l'agente eziologico della sifilide in campioni di siero e sangue intero senza l'uso di speciali apparecchiature di laboratorio ed essere utilizzati nell'assistenza sanitaria di base, tra cui indicazioni epidemiologiche. Limitazioni d'uso: non può essere utilizzato per monitorare l'efficacia della terapia, può dare un risultato falso positivo.

Questi test si basano sulla rilevazione immunocromatografica degli anticorpi contro gli antigeni treponemici del treponema pallido e vengono eseguiti su strisce; in questo caso possono essere utilizzati sia sangue intero che siero (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Il formato dei test consente di condurre ricerche in assenza di attrezzature speciali e senza l'uso di elettricità. Tuttavia, a causa della sensibilità e della specificità relativamente basse, questi test non hanno ancora trovato la loro ampia applicazione nella pratica.

Immunoblotting (Western Blot)

Negli ultimi anni sono apparsi metodi di ricerca volti a rilevare e analizzare il contenuto di anticorpi. per ogni antigene treponema pallido separatamente. Uno di questi metodi è il metodo di immunoblotting (o blotting, immunoblotting, Western blot), che viene utilizzato per determinare gli anticorpi IgG o IgM contro il treponema pallido. Il metodo dell'immunoblotting è una modifica del dosaggio immunoenzimatico, una variante dell'ELISA.

L'immunoblotting è uno dei metodi più moderni di sierodiagnosi della sifilide ed è attivamente utilizzato all'estero. Ha preso il nome ("Western blotting") come risposta umoristica ai nomi delle tecniche di rilevamento del DNA ("Southern Blotting") e dell'RNA ("Northern Blotting").

1. Storia del metodo

L'immunoblotting (Western blot) viene utilizzato per determinare gli anticorpi IgG o IgM contro gli antigeni pallidi del treponema (Herremans M. et al., 2007).

2. Immunoblot classico

Immunoblot classico(Western Blot Analysis) combina il saggio immunoenzimatico e l'uso di un metodo elettroforetico. Gli antigeni proteici dell'agente eziologico della sifilide vengono preliminarmente separati mediante elettroforesi e trasferiti su un trasportatore: una membrana di nitrocellulosa (striscia). Questo trasferimento è chiamato blotting. Quindi questo vettore con punti separati (blots) viene trattato con il siero in esame e gli anticorpi IgG o IgM marcati con enzimi o sostanze radioattive. Il metodo prevede l'uso di proteine ​​del treponema naturali o ricombinanti.

elettroforesiè la separazione di composti carichi in base alla loro mobilità in un campo elettroforetico. Quando una differenza di potenziale viene applicata in un mezzo, le molecole caricate positivamente si muovono verso un elettrodo caricato negativamente e le molecole caricate negativamente si muovono verso un elettrodo positivo.

La maggior parte delle proteine ​​globulari sono assemblate in modo tale che la maggior parte dei gruppi carichi, cioè quelli idrofili, si trovino sulla superficie della proteina, mentre i residui idrofobici privi di carica siano immersi all'interno del globulo. In un campo elettrico, in accordo con la loro carica, le proteine ​​migrano verso un elettrodo di carica opposta.

La separazione elettroforetica delle proteine ​​viene effettuata in un mezzo gel sintetico a base di poliacrilammide. Per separare le proteine ​​in base al loro peso molecolare, prima dell'elettroforesi, la miscela proteica viene preincubata in presenza di sodio dodecil solfato (SDS).

Studi dettagliati di scienziati stranieri Weber e Osborn (1969) hanno dimostrato che dopo tale trattamento, l'unico fattore che può influenzare la mobilità delle proteine ​​​​in un gel di poliacrilammide (PAAG) è la dimensione della proteina, o meglio il suo peso molecolare. Ciò ha permesso di applicare il metodo dell'elettroforesi in SDS-PAGE in presenza di SDS per una determinazione abbastanza accurata del peso molecolare di proteine ​​​​e peptidi. Nella letteratura straniera, questo metodo è stato chiamato SDS-PAGE (elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide).

Profilo di reattività nel classico test WB con antigeni naturali (metodo di elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato). (1) - controllo risultato positivo, (2) - controllo risultato negativo, (3-6) - campioni clinici.

Nei test per la sifilide che utilizzano questo metodo, precedentemente purificato e distrutto nei suoi componenti costitutivi, il treponema pallido viene sottoposto ad elettroforesi in un gel di poliacrilammide o di agarosio. Allo stesso tempo, gli antigeni inclusi nella sua composizione sono separati dal peso molecolare.

Quindi, mediante elettroforesi verticale, gli antigeni vengono trasferiti su una striscia di nitrocellulosa, che ora contiene uno spettro invisibile di bande antigeniche caratteristiche del treponema pallido.

Durante l'analisi, il materiale di prova (siero, plasma sanguigno del paziente, ecc.) viene applicato su una striscia di nitrocellulosa (striscia). Se nel campione sono presenti anticorpi specifici, durante il processo di incubazione si legano fortemente alle bande antigeniche che corrispondono strettamente (complementari) a loro e formano un complesso "antigene-anticorpo".

Dopo la rimozione delle immunoglobuline non legate durante il lavaggio della striscia, segue l'incubazione con un coniugato - anticorpi marcati con enzima contro le immunoglobuline umane (anticorpi contro IgG o IgM umane), durante la quale gli anticorpi marcati con l'enzima sono attaccati all'antigene-anticorpo esistente complessi sulla superficie della membrana.

Dopo la rimozione del coniugato non legato durante l'incubazione con la soluzione del substrato, l'enzima interagisce con il substrato, determinando una reazione cromatica - colorazione delle sezioni di membrana (sotto forma di bande) dove si trovano i singoli antigeni del treponema pallido, gli anticorpi contro che erano nel siero di prova. L'intensità della colorazione dipende dalla quantità di anticorpi legati dal siero. Il risultato della reazione viene valutato visivamente.

La presenza di bande in alcune aree della piastra di nitrocellulosa conferma la presenza nel siero studiato di anticorpi contro antigeni rigorosamente definiti di treponema pallido.

Gli immunodeterminanti 15, 5, 17, 44,5, 47 kD determinati con questo metodo hanno significato diagnostico nella sifilide. L'immunoblotting di Ig G è simile per sensibilità e specificità a RIF con assorbimento (RIF abs). Ig M-immunoblotting può servire come test diagnostico per la sifilide congenita.

3. Immunoblot in formato immunodosaggio lineare

Lineare analisi immunologica(line immunoassay, LIA) consente di determinare simultaneamente gli anticorpi contro gli antigeni del treponema pallido nel siero o nel plasma umano. Gli antigeni sono pre-applicati alle strisce reattive (strisce), che vengono fornite come parte dei kit diagnostici commerciali.

Le strisce sono fatte da membrana di nitrocellulosa, membrana in poliammide con supporto in plastica o membrana in nylon con supporto in plastica. Durante la produzione, diversi antigeni discreti vengono posizionati sulla striscia reattiva come linee antigeniche separate. Oltre a questi antigeni della sifilide, a ciascuna corsia vengono applicate altre quattro linee di controllo: streptavidina e controlli (linea di taglio 3+, 1+ e ±).

Per le strisce vengono utilizzati antigeni artificiali ottenuti dall'ingegneria genetica: proteine ​​​​ricombinanti o costrutti polipeptidici sintetici. Questi sono analoghi antigeni di superficie treponema pallido - TpN15, TpN17, TpN47 e TmpA con un peso molecolare di 15, 17, 47 kDa e 44,5 (TmpA), dove kDa=kiloDalton. Con il loro aiuto, vengono determinati gli anticorpi sierici contro vari componenti immunodominanti dell'agente patogeno.

L'incubazione del campione di prova avviene in una cuvetta, dove è collocata anche la striscia indicatrice. Gli anticorpi contro T. pallidum vengono determinati legandosi agli antigeni stampati sulle strisce reattive. Se nel campione sono presenti anticorpi specifici per T. pallidum, formano legami con le singole linee di antigene. Quando gli anticorpi contenuti nel siero del test interagiscono con gli antigeni discreti di T. pallidum posti sulla striscia reattiva, si forma un complesso antigene-anticorpo sotto forma di bande colorate visivamente rilevabili.

Quando si prendono in considerazione i risultati dell'immunoblotting, la reattività del siero a ciascuno degli antigeni viene valutata separatamente. Una risposta positiva totale viene emessa quando si ottiene un risultato contemporaneamente con due o tre degli antigeni presentati.

Le procedure di ricerca vengono eseguite manualmente o su un analizzatore speciale, con l'interpretazione dei risultati utilizzando un programma informatico specializzato per le malattie infettive.

A causa dell'elevato grado di purificazione degli antigeni ricombinanti e della simultanea rilevazione di anticorpi contro i determinanti più immunogenici dell'agente eziologico della sifilide, il metodo ha un'elevata sensibilità e specificità.

4. Contabilizzazione dei risultati

Per leggere l'intensità della colorazione delle bande antigeniche sulle strisce, sono stati sviluppati fotometri, il cui funzionamento si basa sulla riflessione del segnale, che elimina la valutazione soggettiva e offre una potenziale opportunità di automazione.

5. In quali periodi della malattia è meglio usare

I test che utilizzano il metodo Western blot possono rilevare anticorpi specifici contro gli antigeni del Treponema pallidum in una fase molto precoce della malattia. I più significativi nella diagnosi della sifilide sono gli anticorpi contro gli antigeni del treponema pallido TpN15, TpN17, TmpA e TpN47. Questi antigeni sono proteine ​​di membrana aventi rispettivamente pesi molecolari di 15, 17, 44,5 e 47 kDa.

Quando il treponema pallidum viene introdotto nel corpo umano, gli anticorpi antisifilitici compaiono in questo ordine: prima si sviluppa una risposta immunitaria agli antigeni TpN17, quindi a TpN47, dopo TpN15 e successivamente a tutti i TmpA. Quando si tiene conto dei risultati del test, viene valutata la reattività del siero a ciascuno di essi separatamente. Ad esempio, quando in un linear blot c'è reattività solo alla linea antigenica TpN17 e TpN47, significa che la malattia è in uno stadio iniziale. Più linee antigeniche diventano reattive, più progredisce l'infezione. Nel trattamento della sifilide, il modello di reattività in questo test cambia.

La determinazione delle IgM alle proteine ​​​​con un peso molecolare di 15,17, 41, 47 kDa consente di identificare il 29,2% dei pazienti con sifilide secondaria, il 12,5% con sifilide latente precoce e l'8,0% con sieroresistente. La ricerca di IgG alle stesse molecole è caratterizzata da una sensibilità del 61,6% per sieroresistenti e del 100% per sifilide secondaria e latente precoce.

6. Sensibilità e specificità

Secondo la letteratura, la sensibilità e la specificità del test sono molto elevate, rispettivamente 99,6-100% e 99,3-99,5%. Nel metodo classico, ciò si ottiene attraverso la separazione elettroforetica di proteine, glico- e lipoproteine ​​e la massima specificità di rilevazione dei sieri immuni o degli anticorpi monoclonali. In condizioni ottimali, l'immunoblotting può rilevare l'antigene in quantità inferiori a 1 ng nel volume del test.

Anche la sensibilità del linear blot è del 99,6% e la specificità è compresa tra il 99,3% e il 99,5%.

Secondo gli esperti, l'immunoblotting con antigeni ricombinanti altamente specifici è simile per sensibilità e specificità a RIF abs.

Secondo i dati della letteratura straniera e i risultati di uno studio presso TsNIKVI, il metodo di immunoblotting ha un'elevata sensibilità (98,8-100%) e specificità (97,1-100%) nella diagnosi della sifilide.

7. Ambito del metodo

L'immunoblotting (immunoblot) è un metodo di riferimento altamente specifico e altamente sensibile. Alta sensibilità e la specificità consentono a questo metodo di essere considerato un test di conferma per la sifilide. Il metodo può essere utilizzato per confermare la diagnosi, così come se altri test treponemici danno risultati discutibili e contrastanti. Il Western blotting può confermare la diagnosi nei pazienti con risultati positivi o indeterminati, compresi quelli ottenuti utilizzando TPHA o ELISA.

8. Fonti e cause di errori di messa in scena, falsi positivi e falsi negativi

I risultati falsi positivi sono molto rari. Anche i risultati falsi negativi sono piuttosto rari e si osservano in pazienti con immunodeficienze - più spesso nelle persone con infezione da HIV e con l'effetto di una "finestra" diagnostica dovuta a un ritardo nella sintesi degli anticorpi, nonché a errori nella fase di stadiazione.

L'uso di moderni sistemi di test impone l'esatta osservanza di tutti i requisiti sia per il materiale che per le prestazioni della reazione. Fondamentalmente, la fonte degli errori è una violazione dell'ordine e della tecnologia dello studio (soprattutto per il classico Western blot), il mancato rispetto delle raccomandazioni dei produttori di kit di test. . Errori possono essere commessi anche nella raccolta, consegna, conservazione dei campioni di siero sanguigno, nonché nell'esecuzione dei test. Oltre ai campioni contaminati, altre possibili cause includono l'uso di kit di test scaduti ed errori nell'analisi dei risultati del test.

9. Caratteristiche, vantaggi e svantaggi

L'unicità dell'immunoblot risiede nel suo elevato contenuto di informazioni e nell'affidabilità dei risultati.

Il test non richiede antigeni altamente purificati, sieri di riferimento e di controllo. L'identificazione di un bersaglio anticorpale si basa sul peso molecolare della proteina con cui reagiscono gli anticorpi del siero del paziente. In una reazione è possibile rilevare il legame degli anticorpi a diversi antigeni, ciascuno dei quali può essere caratterizzato con precisione. A causa di ciò, l'immunoblotting presenta numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi per rilevare gli anticorpi, i cui risultati dipendono dalla standardizzazione, dalla sensibilità, dalla qualità del substrato, dall'instabilità o dall'insolubilità di alcuni antigeni.

Il metodo è facilmente riproducibile, relativamente facile da eseguire e interpretare i risultati, consente di determinare contemporaneamente lo spettro di anticorpi contro diversi antigeni di T. pallidum e valutare il contributo di anticorpi di diversa specificità alla reazione complessiva.

L'uso di antigeni ricombinanti e peptidici altamente purificati riduce al minimo la reattività aspecifica dei sieri. L'uso del metodo consente di evitare metodi laboriosi e soggettivi che sono pericolosi per il ricercatore (trapianto di ceppi di G. pallidum, lavoro con T. pallidum patogeno durante l'impostazione di una reazione). Ciò determina la preferenza per il metodo dell'immunoblotting rispetto ad altri test treponemici (RIF e soprattutto RIBT) per la diagnosi della sifilide.

10. Modifiche al metodo

Esistono diversi sistemi di test commerciali basati su questo metodo. Alcuni di loro sono nel formato macchia occidentale, sono costituiti da strisce su cui vengono trasferite componenti proteiche di T. pallidum, precedentemente separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.

Altri sono nel formato macchia lineare, sono costituiti da strisce su cui vengono adsorbiti polipeptidi ricombinanti e sintetici sotto forma di linee discrete - analoghi degli antigeni di superficie di T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 e TmpA.

I risultati del Western blot sono più difficili da interpretare perché le strisce mostrano un'ampia varietà di anticorpi, molti dei quali sono specifici del gruppo. Al contrario, l'interpretazione dei risultati del blot lineare è semplice; inoltre, ulteriori linee di controllo stampate sulla striscia consentono una valutazione semiquantitativa del livello di anticorpi contro i quattro antigeni di T. pallidum.

Tecnologia xMAP

xMAP è una tecnologia all'avanguardia che consente di eseguire studi multiparametrici rilevando simultaneamente più analiti in un singolo campione biologico. Come fase solida vengono utilizzate microsfere colorate rivestite con reagenti di cattura (oligonucleotidi, anticorpi, antigeni).

Il campione di prova viene aggiunto alla soluzione contenente le microsfere. Gli analiti rilevati nel campione vengono legati alla microsfera corrispondente, dopodiché viene aggiunto alla soluzione un agente di rilevamento (anticorpi di rilevamento, marcatore fluorescente). Per rilevare l'analita da determinare viene utilizzato un sistema di due laser, che consente sia una valutazione qualitativa della presenza di un analita in un campione (per questo viene utilizzato un laser rosso che classifica le microsfere per colore) sia una valutazione quantitativa del contenuto di analita in un campione (per questo viene utilizzato un laser verde).

Gli esami del sangue sierologici sono estremamente importanti. Attualmente viene utilizzato un complesso di reazioni sierologiche - di solito mettono la classica reazione di Wassermann e due reazioni sedimentarie. Delle reazioni sedimentarie, le reazioni Kahn, Zaks-Vitebsky e citocoliche sono più spesso utilizzate.

I risultati degli studi sierologici sono indicati da più come segue: + + + + fortemente positivo, + + + positivo, + + e + debolmente positivo; una reazione negativa è indicata da un segno meno (-).

Oltre al complesso specificato di reazioni sierologiche, negli ultimi anni è stata ampiamente riconosciuta la reazione di immobilizzazione dei treponemi pallidi (test Nelson-Meyer), che viene eseguita con un antigene specifico (sospensione dei treponemi pallidi). Questa reazione è più specifica del suddetto complesso di reazioni che vengono eseguite con antigeni non specifici. Il test Nelson-Meyer è di particolare valore quando si decide sulla specificità di una reazione di Wassermann positiva e reazioni sedimentarie in individui che non presentano sintomi di sifilide.

Reazioni sierologiche in diversi periodi di sifilide. Valore diagnostico le reazioni sierologiche in diversi periodi di sifilide non sono le stesse. Nel periodo primario - entro 2-3 settimane dall'insorgenza del sifiloma primario - le reazioni sierologiche sono generalmente negative; a partire dalla 3-4a settimana diventano positivi in ​​alcuni pazienti. Man mano che la malattia si avvicina al periodo secondario, la percentuale di reazioni sierologiche positive aumenta e, quando compaiono i sintomi secondari della sifilide, diventano positivi in ​​​​quasi il 100% dei pazienti.

Nei nuovi periodi secondari e ricorrenti della malattia, le reazioni sierologiche nel sangue rimangono positive in quasi il 100% dei pazienti.

Nel periodo terziario della sifilide con manifestazioni attive della malattia, le reazioni sierologiche spesso, in circa il 15% dei pazienti, possono essere negative e, in assenza di manifestazioni attive della malattia, il numero di reazioni negative può raggiungere il 30-40% .

Reazioni sierologiche come criterio per il successo del trattamento della sifilide. Il trattamento specifico della sifilide deve essere effettuato sotto il controllo delle reazioni sierologiche. Di solito, nei pazienti con periodo fresco sieropositivo primario e secondario, le reazioni sierologiche diventano negative dopo 1-2 mesi di trattamento razionale della sifilide; nel periodo ricorrente secondario, possono diventare negativi contemporaneamente o un po' più tardi. Se, entro i termini indicati, le reazioni sierologiche non diventano negative, ciò indica una mancanza di efficacia del trattamento. In tali casi, è necessario migliorare l'efficacia della terapia, ma non aumentando il dosaggio dei farmaci, ma modificando il metodo di trattamento e aggiungendo metodi terapeutici non specifici.

Reazioni sierologiche fortemente positive in assenza di sintomi clinici possono essere considerate un sintomo di sifilide, a condizione che rimangano fortemente positive alla ripetizione del test e che il test sia stato eseguito in un laboratorio sierologico qualificato.

Reazioni sierologiche debolmente positive in assenza di sintomi clinici e altri reperti non possono supportare la diagnosi di sifilide; tali risultati dovrebbero essere presi in considerazione solo in quei casi in cui il paziente ha avuto la sifilide in passato ed è stato sottoposto a trattamento appropriato. Reazioni sierologiche debolmente positive possono anche essere importanti se il paziente ha una malattia di eziologia sconosciuta. In questi casi, i risultati delle reazioni sierologiche devono essere valutati tenendo conto di altri dati anamnestici, clinici e di laboratorio.

Reazioni sierologiche non specifiche può essere visto in molte malattie. Quindi, un risultato nettamente positivo si verifica spesso con la lebbra e la febbre ricorrente. Nella malaria, nella tubercolosi, nella brucellosi e in molte altre malattie infettive, così come nei pazienti con tumori maligni, i risultati sono generalmente debolmente positivi o positivi (+ + +) e raramente nettamente positivi (+ + + +).

L'uso di bevande alcoliche o cibi grassi prima dello studio può causare una reazione debolmente positiva aspecifica. Il sangue per i test sierologici deve essere prelevato a stomaco vuoto.

In assenza di un laboratorio sierologico, si consiglia di inviare il sangue per la ricerca per posta in una busta a forma di "goccia secca".

Per ottenere una goccia secca, si raccolgono in una provetta 5 ml di sangue dalla vena cubitale. La provetta con il sangue viene lasciata per 2 ore a temperatura ambiente. Il coagulo di sangue risultante viene separato dalle pareti del tubo con un filo calcinato e raffreddato, quindi il sangue viene posto in un luogo fresco fino al mattino successivo. Il giorno successivo si raccolgono 0,75 ml di siero con una pipetta graduata, che viene applicata su carta oleata o su una striscia di cellophane. Il siero su carta o cellophane viene lasciato fino al giorno successivo a temperatura ambiente, proteggendolo da polvere e mosche. Successivamente, la carta oleata o il cellophane con siero di latte essiccato vengono arrotolati nella forma polvere da farmacia, metterlo in una busta e, insieme a una nota di accompagnamento, inviarlo per posta al laboratorio sierologico più vicino.

Va notato che il metodo delle reazioni sierologiche che utilizza una "goccia secca" di sangue è meno affidabile del solito.