Жаропонижающие средства для детей назначаются педиатром. Но бывают ситуации неотложной помощи при лихорадке, когда ребенку нужно дать лекарство немедленно. Тогда родители берут на себя ответственность и применяют жаропонижающие препараты. Что разрешено давать детям грудного возраста? Чем можно сбить температуру у детей постарше? Какие лекарства самые безопасные?
Оценка В-системы иммунитета (гуморальный иммунитет).
Для оценки В-системы иммунитета применяют несколько методов.
Определение В-лимфоцитов в крови . Используют три свойства лимфоцитов этого типа.
Наличие рецепторов к комплементу дает возможность подсчитать так называемые комплементарные розетки, т.е. лимфоциты, образующие розетки с эритроцитами, несущими на своей поверхности комплекс антитело - комплемент (ЕАС-розеткообразование). К розеткообразованию способны не только лимфоциты, но и гранулоциты. И. Вонг, А. Уилсон в 1975 г. описали технику постановки ЕА- и ЕАС-розеткообразования нейтрофилами, что доказало наличие у этих клеток Fс-рецепторов. В 1976 г. И. В. Петрова и соавт. описали способность нейтрофилов к спонтанному розеткообразованию с эритроцитами барана и было показано, что эта субпопуляция нейтрофилов резко возрастает при иммунодепрессивной терапии. По аналогии с лимфо- цитами нейтрофилы делят на спонтанные розеткообразующие клетки, комплементарные розеткообразующие клетки и нулевые. У здоровых людей спонтанных розеткообразующих нейтрофилов имеется от 25 до 35%, а комплементарных - от 14 до 20%.
рис. 1. Розеткообразование В- клеток.
Наличие у В-лимфоцитов рецепторов к Fс-фрагменту иммуноглобулинов приводит к тому, что они адсорбируют на себе агрегированный γ-глобулин. Выявить В-лимфоциты можно с помощью флюоресцентного или радиографического метода, используя меченые агрегаты γ-глобулинов. Человеческие В-лимфоциты образуют розетки с мышиными эритроцитами. Наконец, с помощью иммунофлюоресцентного метода Кунса, применяя антиглобулиновые сыворотки, можно обнаружить и подсчитать все лимфоциты, несущие иммуноглобулиновые детерминанты, т. е. В-лимфоциты. При этом можно провести дифференцированный подсчет клеток, несущих IgМ-, IgG или 1gА-детерминанты. Так же необходимо определять не только процент В-клеток, но и их абсолютное количество в 1 мкл крови.
Определение в крови уровня иммуноглобулинов. Проводят определение суммарной концентрации иммуноглобулинов и количество иммуноглобулинов разных классов. Первое осуществляется методом высаливания сульфа-том цинка с последующей турбидиметрической оценкой, электрофорезом или иммуноэлектрофорезом. Нормальный уровень суммарных иммуноглобулинов у человека составляет от 10 до 20 г/л. Определение количества IgМ, IgG и IgА чаще всего осуществляется методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. IgЕ определяется радиоиммунологическим методом. Верхняя граница нормы составляет 0,0005 г/л.
Определение наличия и уровня изогемагтлютининов в сыворотке крови, а также естественных (нормальных) антител к широко распространенным бактериям и вирусам. В качестве антигенов можно использовать кишечную палочку, стафилококковые токсины, вирус герпеса и др. Следует иметь в виду, что ά- и β-изогемагглютинины относятся к IgМ.
Исследование антителогенеза (первичного и вторичного ответа) после акти-вной иммунизации несколькими убитыми вакцинами. Применяют коклюшную и убитую полиомиелитную вакцины, дифтерийный и столбнячный анатоксины, полисахаридные антигены, выделенные из пневмококков, менингококков и бактерий кишечной группы. Необходимость использования нескольких антигенов связана с генетически детерминированной конкретностью иммунного ответа. Получение низкого иммунного ответа на какой-то один антиген может оказаться результатом того, что данный индивидуум относится к низкоотвечающему на данный антиген генотипу. Реакция на другие антигены может быть нормальной. Вот почему диагноз функциональной неполноценности В-системы можно поставить только при угнетении иммунного ответа на несколько разных антигенов.
Исследование катаболизма иммуноглобулинов в организме. В кровь вводят меченый препарат человеческого иммуноглобулина. Клиренс метки из крови и ее накопление в моче и испражнениях дают возможность определить период полужизни иммуноглобулина. В норме период полужизни IgG равен 24 дням. При экссудативной энтеропатии, нефрозах и некоторых других заболеваниях возникает состояние гиперкатаболизма иммуноглобулинов. Для установления факта избирательного их гиперкатаболизма параллельно определяют период полужизни меченого альбумина.
Биопсия лимфатических узлов , костного мозга, участков слизистой оболочки кишечника. Эту процедуру проводят с целью гистологического обнаружения плазматических клеток, наличия и структуры лимфоидных фолликулов. Кожные реакции, выявляющие гиперчувствительность немедленного типа. К таким пробам относится ШИК-реакция. У людей, иммунизированных против дифтерии, в организме которых содержатся антитела против дифтерийного токсина, внутрикожная инъекция этого токсина не приводит к развитию типичной эритемы.
Стимуляция биосинтеза иммуноглобулинов В-лимфоцитами in vitro. Оценка функциональной активности В-лимфоцитов из крови человека возможна благодаря тому, что некоторые митогены, например митоген лаконоса, обладают способностью вызывать поликлональную стимуляцию В-лимфоцитов. «Валовую» продукцию В-клеток, синтезирующих иммуногло-булины, определяют в культуральной жидкости радиоиммунологическим методом через 7-12 дней культивирования лимфоцитов с митогеном.
рис. 2. Гуморальный иммунный ответ.
В-лимфоциты вырабатывают антитела, помогая распознавать и удалять чужеродные антигены (переносимые бактериями или вирусами). Им помогают циркулирующие в крови Т-лимфоциты и макрофаги.
а) Вирусные частицы через поверхностные клетки проникают в ткань и размножаются.
б) Макрофаги пожирают вирусные частицы,
в) Макрофаги передают антигены циркулирующим в крови Т-лимфоцитам. Это приводит к мобилизации дополнительного количества Т- и В-лимфоцитов.
г) В-лимфоциты распадаются на плазматические В-клетки, которые производят антитела, специфичные для проникшего вируса, и В-клетки памяти.
д) Циркулирующие в крови антитела взаимодействуют с вирусными частицами.
е) Макрофаги распознают и пожирают вирусы, защищая организм от инфекций. 
рис.3. Взаимодействие клеток при иммунном ответе.
Рецептор Т-хелпера распознаёт антигенную детерминанту (эпитоп) вместе с молекулой ГКГ 11 класса, выставленные на поверхности Аг-представляющей клетки. В молекулярном взаимодействии участвует дифференцировочный Аг Т-хелпера СD4. В результате подобного взаимодействия Аг- представляющая клетка секретирует ИЛ-1, стимулирующий в Т-хелпере синтез и секрецию ИЛ-2, а также синтез и встраивание в плазматическую мембрану того же Т-хелпера рецепторов ИЛ-2. ИЛ-2 стимулирует пролиферацию Т-хелперов и активирует цитотоксические Т-лимфоциты. Отбор В-лимфоцитов произво-дится при взаимодействии Аг с Fаb -фрагментами Ig М на поверхности этих клеток. Эпитоп этого Аг в комплексе с молекулой ГКГ II класса узнаёт рецептор Т-хелпера, после чего из Т-лимфоцита секретируются цитокины, стимулирующие пролиферацию В-лимфоцитов и их дифференцировку в плазматические клетки, синтезирующие АТ против данного Аг. Рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов связывается с антигенной детерминантой в комплексе с молекулой ГКГ I класса на поверхности вирус- инфицированной или опухолевой клетки. В молекулярном взаимодействии участвует диффе-ренцировочный Аг цитотоксического Т-лимфоцита СD 8. После связывания молекул взаимодействующих клеток цитотоксический Т-лимфоцит убивает клетку-мишень.
Рис. 5. Трехклеточная система взаимодействия при развитии гуморального иммунного ответа.
В-лимфоцит получает специфическую информацию об антигене от поглотившего чужеродный материал макрофага и неспецифическую - от индуктора иммунопоэза (ИИ), секретируемого Т-лимфоцитом после распознавания антигена. В условиях, когда кооперируют все три типа клеток, развивается полноценный иммунный ответ. Если В-клетка получает только информацию об антигене от макрофага, а помощь со стороны Т-клетки отсутствует, то индуцируется специфическая неотвечаемость - толеран-тность. При действии на В-клетку только ИИ происходит синтез неспецифических иммуноглобулинов.
Рис. 6. Взаимодействие между клетками вилочковой железы (источника Т-клеток) и клетками костного мозга (источника В-клеток) при индукции гуморального иммунного ответа.
Гуморальный ответ развивается как комплексный процесс, который включает несколько типов клеток. Введение облученным мышам только клеток костного мозга - ККМ (В-лимфоцитов) или только клеток вилочковой железы - КВЖ (Т-клеток) не обеспечивает развитие иммунного ответа достаточной силы. В то же время введение смеси этих клеток приводит к формированию интенсивной продукции антител к эритроцитам барана. Причем ответ при таком совместном введении клеток значительно выше, чем сумма ответов при раздельном введении клеток различного происхождения. Иначе кооперация различных типов клеток приводит к синергическому эффекту. Ответ оценивали по количеству бляшкообразующих клеток (БОК) в селезенке.
Рис. 7. Развитие гуморального иммунного ответа.
«Суммарная» схема, учитывающая субпопуляции лимфоцитов, которые участвуют в индукции антителогенеза, переключение синтеза IgМ на синтез IgG и создание клеток памяти. Захваченный макрофагами (МФ) антиген (АГ) выводится на клеточную поверхность в иммуногенной форме. В реакцию распознавания АГ вступают «ранние» Т-хелперы с фенотипом, которые способствуют созреванию «поздних» Т-хелперов, помогающих антителопродукции. Развитие первичного IgМ-ответа не требует помощи со стороны Тх Lуt1. Для накопления плазматических клеток, продуцирующих IgМ-антитела (ПК IgМ), очевидно, достаточно простого распознавания АГ на поверхности МФ. Однако помощь Тх Lуt1необходима для внутриклеточного переключения синтеза IgМ на синтез IgG, накопления плазматических клеток, синтезирующих и секретирующих IgG (ПК IgG) и вступления клеток памяти (КП IgG) во вторичный иммунный ответ.
Клеточный иммунный ответ характеризуется пролиферацией коммитированных иммунокомпетентных клеток, реагирующих с Аг в комплексе с молекулой ГКГ I класса на поверхности чужеродных клеток или эндогенными иммуногенами в комплексе с молекулой ГКГ I класса на поверхности собственных вирус- инфицированных и опухолевых клеток. В клеточном иммунном ответе участвует цитотоксический Т-лимфоцит. Цитотоксический Т-лимфоцит (Тс ). Предъявленный на поверхности клетки-мишени Аг в комплексе с молекулой ГКГ I класса связывается с рецептором цитотоксического Т-лимфоцита. В этом процессе участвует молекула СD8 клеточной мембраны Тс. Секретируемый Т-хелперами ИЛ-2 стимулирует пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов. Уничтожение клетки-мишени. Цитотоксический Т-лимфоцит распознаёт клетку-мишень и прикрепляется к ней. В цитоплазме активированного цитотоксического Т-лимфоцита присутствуют мелкие тёмные органеллы, напоминающие запасающие гранулы секреторных клеток. Гранулы концентрируются в той части Т-киллера, которая расположена ближе к месту контакта с клеткой-мишенью. Параллельно происходят переориентация цитоскелета и смещение в эту область комплекса Гольджи, в котором и формируются гранулы. В них содержится цитолитический белок перфорин.
Выделяемые Т-киллером молекулы перфорина полимеризуются в мембране клетки-мишени в присутствии Са 2+. Сформированные в плазматической мембране клетки-мишени перфориновые поры пропускают воду и соли, но не молекулы белка. Если полимеризация перфорина произойдет во внеклеточном пространстве или в крови, где в избытке имеется кальций, то полимер не сможет проникнуть в мембрану и убить клетку. Специфическое действие Т-киллера проявляется только как результат тесного контакта между ним и клеткой-мишенью, который достигается за счёт взаимодействия Аг на поверхности жертвы с рецепторами Т-киллера. Сам Т-киллер защищен от цитотокси-ческого действия перфорина. Механизм самозащиты неизвестен. Альтернативный механизм уничтожения клетки-мишени, согласно которому цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки являются источником сигнала, который запускает уже предсуществующую суицидальную программу в клетке-мишени. Действие этого сигнала усиливают глюкокортикоиды.
-количественная оценка:
1. Определение количества В-лимфоцитов методом ЕАС – розеткообразования (ЕАС-РОК).
Принцип метода: аналогичен реакции розеткообразования для выявления Т-лимфоцитов, но вместо эритроцитов барана используются эритроциты быка (Е), нагруженными антителами (А) и комплементом (С). Взаимодействие обусловлено наличием у В-лимфоцитов рецепторов к комплементу.
2. Определение числа В-лимфоцитов (CD20+ или CD19+) с помощью ИФА и проточной цитометрии.
- качественная (функциональная) оценка :
1. Определение концентрации иммуноглобулинов в реакции преципитации по Манчини и ИФА.
Принцип метода по Манчини: образцы исследуемой сыворотки помещают в лунки агарового геля, который содержит антитела против иммуноглобулина определенного класса. Иммуноглобулины, диффундирующие в агар, при взаимодействии с соответствующими антителами образуют кольца преципитата, диаметр которых пропорционален концентрации иммуноглобулинов соответствующего класса в исследуемой сыворотке. Концентрацию иммуноглобулина определяют по заранее построенному с помощью эталонных сывороток графику (калибровочной кривой).
2. Определение функциональной активности лимфоцитов с помощью РБТЛ на В-митоген.
3. Определение продукции ИЛ-6 с помощью ИФА и проточной цитометрии.
КОЖНЫЕ АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ ПРОБЫ
Применяются для выявления ГЗТ (инфекционной аллергии). ГЗТ – реакция, опосредованная Т-лимфоцитами играют важную роль в патогенезе многих инфекций (туберкулеза, лепры, бруцеллеза, сифилиса и др.).
Для постановки аллергических проб применяются аллергены (корпускулярные и растворимые):
Растворимые аллергены - отдельные фракции клеточной стенки, выделенные из микробов:
1) очищенный туберкулин (ППД-Л) – очищенный белок (низкомолекулярный белок) туберкулезной палочки. Применяется для выявления аллергии к возбудителю туберкулеза (проба Манту);
2) аллерген бруцеллезный (бруцеллин) – полисахаридно-белковый комплекс B. аbortus. Применяется для выявления аллергии к возбудителю бруцеллеза.
3) аллерген сибироязвенный (антраксин) – белковонуклиосахаридный комплекс. Применяется для выявления аллергии к возбудителю сибирской язвы.
Корпускулярные аллергены (взвесь убитых микробов):
1) аллерген туляримийный (тулярин) применяется для выявления аллергии к возбудителю туляремии.
2) лепромин применяется для выявления аллергии к возбудителю лепры.
Принцип метода: внутрикожно или накожно в ладонную поверхность предплечья вводится небольшое количество аллергена. При наличии инфекционной аллергии через 24-48-72 час. Развивается инфекционная аллергия в виде гиперемии, инфильтрата, отека кожи (рис.17).
Рис. 17. Механизм ГЗТ.
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
Выберите один правильный ответ
1. С какой целью применяется реакция Кумбса?
1) для обнаружения опсонинов;
2) для обнаружения неполных антител;
3) для установления вида микроорганизма;
4) для определения серовара микроорганизма;
5) для обнаружения антитоксинов.
2. Укажите механизм первой стадии серологической реакции
1) агглютинация;
2) преципитация;
3) соединение АГ с АТ;
5) связывание комплемента.
3. Какую реакцию можно использовать для оценки состояния Т-звена иммунной системы?
3) проточную цитометрию;
4) опсоно – фагоцитарную реакцию.
4.Какой феномен серологических реакций наблюдается, если антигеном является экзотоксин?
1) преципитация;
2) агглютинация;
3) опсонизация;
5) нейтрализация.
5. ЕАС-РОК основан на выявлении…
1) С3 рецептора В-клеток;
2) С3 рецептора А-клеток;
3) рецепторов к эритроцитам;
4) Fс-рецепторов.
6. ЕА-РОК основан на выявлении…
1) С3 рецепторов В-клеток;
2) Fc-рецепторов А-клеток;
3) Fc-рецепторов Т-клеток;
4) рецепторов к эритроцитам.
7. Назовите компоненты системы комплемента, обладающие опсонизирующими свойствами
8.Назовите компоненты системы комплемента, обеспечивающие литическое действие
4) С3А, С3В;
9.Рабочая доза комплемента равна …
1) титру комплемента;
2) титру, сниженному на 25-30%;
3) титру, увеличенному на 25-30%;
4) 1/2 титра.
10. Назовите маркера Т-киллеров
11. Активацию Т – лимфоцитов вызывает…
1) митоген Лаконоса;
2) липополисахарид;
3) фитогемагглютинин;
5) поливинилпирролидон.
12.Лимфобласт – это…
13. Назовите цитокина Т-хелпера, стимулирующего пролиферацию и дифференцировку других субпопуляций Т-клеток
1) интерлейкины;
14. В реакции агглютинации участвует антиген…
1) растворимые;
2) корпускулярные;
15. Повышением чувствительности бактерий к фагоцитозу является реакция…
1) агглютинации;
2) нейтрализации токсина;
3) опсонизации;
4) связывание комплемента;
5) преципитации.
16. Какие антигены участвуют в реакции агглютинации?
2) полисахариды;
3) экзотоксин;
4) микробные клетки.
17. Назовите антигены - маркеры Т-киллеров
18. Какая реакция применяется для идентификации Т-лимфоцитов?
2) ЕА - РОК;
3) ЕАС - РОК;
19. Активацию Т – лимфоцитов вызывает…
1) митоген Лаконоса;
2) липополисахарид;
3) фитогемагглютинин;
5) поливинилпирролидон.
20. Лимфобласт – это…
1) лимфоцит в конечной фазе дифференцировки;
2) лимфоцит с цитотоксическими эффекторными свойствами;
3) предшественник зрелых лимфоцитов;
4) лимфоцит в фазе интенсивного размножения.
21. Показателем активности инфекционного процесса является...
22. АГ – 2-х млрд. взвесь бактерий на физиологическом растворе вызывает следующий феномен серологической реакции:
1) преципитация;
2) агглютинация;
3) опсонизация;
5) флокуляция.
23. Детерминанты иммуноглобулинов, взаимодействующие с антиглобулиновыми антитела, применяемыми в «непрямых» серологических реакциях?
1) идиотипическими;
2) аллотипическими;
3) изотипическими.
24. Иммунным интерфероном является…
1) бетта- интерферон;
2) гамма-интерферон;
3) альфа- интерферон.
25. Часть молекулы антитела, ответственная за активацию комплемента
1) «L» - цепи;
2) Fс– фрагмент;
3) Fав – фрагмент;
4) активные центры;
26. Назовите цитокин Т-хелпера, стимулирующий пролиферацию и дифференцировку других субпопуляций Т-клеток
27. Какие антитела используют для иммуноферментного анализа?
1) антител, реагирующих с ферментами;
2) антител, коньюгированных с ферментами
3) антител, нейтрализующих действие ферментов.
28. Какое время требуется для проявления ГЗТ к аллергену?
1) несколько минут;
4) 12 часов;
5) не ранее 6 часов.
29. Какие лимфоциты играют главную роль при ГЗТ?
1) В1-лимфоциты;
2) В-лимфоциты;
3) Т-хелперы;
4) сенсибилизированные Т - лимфоциты;
5) Т-киллеры.
30. Активацию В – лимфоцитов не вызывают…
1) фитогемагглютинин;
2) коканавалин А;
3) липополисахарид;
4) антигены;
5) цитокины.
31. Классический путь активации комплемента запускается…
1) комплексом АГ – АТ;
2) липополисахаридами микробов;
3) через пропердиновую систему.
32. Назовите функцию, которую не вызывают активированные компоненты комплемента.
1) разрушают клетки;
2) усиливают фагоцитоз;
3) участвуют в анафилактических реакциях;
4) вызывают хемотаксис;
5) стимулируют антителообразование.
33.Какие рецепторы имеются на макрофагах?
3) эритроцитов.
34. Укажите название сыворотки, необходимую для постановки реакции агглютинации с целью серодиагностики
1) диагностикум;
2) испытуемая сыворотка;
4) диагностическая сыворотка;
5) комплемент.
35. Назовите способ постановки реакции агглютинации
1) в специальных пробирках диаметром 0,5 см;
2) на стекле;
36. Назовите рецептор – маркер Т лимфоцитов
1) FC - рецепторы для Ig;
2) к эритроцитам мыши;
3) СЗ рецепторы для комплемента;
4) к эритроцитам барана.
37. Назовите рецептор, имеющийся на В-лимфоцитах
1) вируса кори;
2) вируса герпеса;
3) вируса Эпштейн – Барра;
4) эритроцитов барана.
38. Активацию В-лимфоцитов вызывают следующие вещества
1) фитогемагглютинин;
2) коканавалин А.
39. Цитокины – это…
1) белки, образуемые активированными клетками иммунной системы;
2) интерфероны;
3) интерлейкины;
5) лейкины.
40. Назовите антиген, участвующий в реакции РП
1) корпускулярный;
2) растворимый.
41. Назовите основные способы постановки РП
1) реакция на стекле;
2) реакция в геле;
3) развернутая реакция.
42. Назовите условия, определяющие скорость серологических реакций
1) оптимальное соотношение антигена и антитела;
2) рН среды;
3) степень специфичности антигена и антитела;
4) температура;
5) концентрация электролитов.
43. Назовите рецептор – маркер Т- лимфоцитов
1) Fс – рецептор для IgА;
2) для эритроцитов мыши;
3) СЗ – рецептор для комплемента;
4) для эритроцитов барана.
44. Кожно-аллергические пробы применяются для выявления следующих реакций
1) анафилактической реакции;
2) цитотоксической реакции;
3) иммунокомплексной реакции;
4) клеточно-опосредованной реакции.
45. Назовите компонент-антиген РНГА
1) эритроцитарный диагностикум;
2) физиологический раствор;
3) сыворотка больного;
4) сыворотка морской свинки;
5) гемолитическая сыворотка.
46. Назовите аллергены, применяемые для выявления ГЗТ
1) взвесь убитых бактерий;
2) пыльца растений;
3) вирусы.
47. Инфекционная аллергия - это повышенная чувствительность к…
1) аллергенам микроорганизмов;
2) сывороточным аллергенам;
3) пыльцам растений;
4) пищевым аллергенам.
48. Кожно-аллергические пробы, применяемые при туберкулезе
1) р. Манту;
2) р. Бюрне;
3) р. с тулярином;
4) р. с антраксином;
5) р. с кандидозным аллергеном.
49. Диагностическая система РСК включает следующий антиген
1) комплемент;
2) диагностикум;
3) сыворотку крови больного;
4) эритроциты барана;
5) гемолитическую сыворотку.
50. Индикаторная система РСК включает следующий антиген
1) комплемент;
2) диагностикум;
3) сыворотку крови больного;
4) эритроциты барана;
5) гемолитическую сыворотку.
51. С какой целью применяется р. опсонизации?
1) выявления АТ в исследуемой сыворотке;
2) выявления АТ к вирусам;
3) идентификации микробных АГ;
4) установления серовара бактерий.
52. Назовите реагенты, используемые для выявления антител в непрямом методе иммуноферментного анализа
1) меченые антитела против антигена;
2) меченые антитела против иммуноглобулинов;
3) немеченые антитела против иммуноглобулинов;
4) комплемент.
53. Назовите ингредиент, служащей меткой для постановки иммуноферментного анализа
1) индикаторный фермент;
2) антигены;
3) энзиммеченные антитела;
4) немеченые антитела;
5) хромоген.
54. Назовите методы иммунохимического анализа, в которых используется хромогенный субстрат
1) радиоиммунный анализ;
2) иммунофлюоресцентный анализ;
3) иммуноэлектрофорез;
4) иммуноблоттинг.
55. Выберите характеристику метода иммуноблотинга
1) основан на сочетании электрофореза и иммуноферментного анализа.;
2) позволяет выявлять нуклеотидов;
3) позволяет судить о сероконверсии;
4) включает использование меченых антител.
56. С какой целью применяется реакция нейтрализации?
1) опсонинов
2) токсинов
3) неполных антител
4) антигена, полученного путем кипячения.
57. Назовите антигены, участвующие в реакции нейтрализации
2) полисахариды;
3) корпускулярные антигены;
4) экстракты клеток.
58. Реакция преципитации применяются с целью…
1) выявления антител в исследуемой сыворотке;
2) выявления антител к вирусам;
3) идентификации микробных антигенов;
4) установления серовара бактерий;
5) установления серогруппы микроорганизмов.
59. Назовите реакцию используемую для определения неполных антител
1) реакция Оухтерлони;
2) реакция Кумбса;
3) реакция Вассермана
60. Назовите сыворотку, применяемую для нейтрализации биологической активности вируса
1) антитоксическая сыворотка;
2) противовирусная сыворотка;
3) экзотоксин;
61. Назовите индикаторный объект в РН для определения цитопатогенного действия вируса
1) куриные эмбрионы;
2) лабораторные животные;
4) иммунная сыворотка;
5) тканевая культура
62. Реакции нейтрализации основаны на ингибировании антителами…
1) инфекционного свойства вирусов;
2) куриного эмбриона
63. Реакции РН применяются для определения…
1) активности экзотоксинов;
2) активности эндотоксинов
64. Назовите способы постановки РН.
1) в организме лабораторных животных;
2) на стекле капельным способом
65. Индикаторами РН являются…
1) латекс-частицы;
2) эритроциты
66. Определение иммуноглобулинов по Манчини – это…
1) РП в геле;
2) РП в пробирках;
ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
| 1. | 23. | 45. | |||
| 2. | 24. | 46. | |||
| 3. | 25. | 47. | |||
| 4. | 26. | 48. | |||
| 5. | 27. | 49. | |||
| 6. | 28. | 50. | |||
| 7. | 29. | 51. | |||
| 8. | 30. | 52. | |||
| 9. | 31. | 53. | |||
| 10. | 32. | 54. | |||
| 11. | 33. | 55. | |||
| 12. | 34. | 56. | |||
| 13. | 35. | 57. | |||
| 14. | 36. | 58. | |||
| 15. | 37. | 59. | |||
| 16. | 38. | 60. | |||
| 17. | 39. | 61. | |||
| 18. | 40. | 62. | |||
| 19. | 41. | 63. | |||
| 20. | 42. | 64. | |||
| 21. | 43. | 65. | |||
| 22. | 44. | 66. |
СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ
Задача 1. Из испражнения больного с подозрением на дизентерию выделена чистая культура Sh.flexneri. Какая серологическая реакция позволит определить серотип возбудителя для расшифровки эпидемиологической обстановки? Назовите компоненты реакции.
Задача 2. В клинику поступил больной с предполагаемым диагнозом: «Грипп», «Парагрипп». Для экспресс - диагностики поставлен непрямой способ РИФ. Назовите компонентов реакции.
Задача 3. В инфекционную больницу поступили двое больных с предполагаемым диагнозом «Гепатит А». У первого больного в сыворотке крови обнаружены IgM против вируса гепатита А, а у второго – IgG. С помощью какого метода можно определить Ig? У кого из больных подтвержден диагноз и почему?
Задача 4. Выделена чистая культура вируса полиомиелита. Требуется определение серотипа вируса (1,2,3) в реакции нейтрализации на тканевой культуре. Назовите ингредиентов и механизм реакции.
Задача 5. В вирусологическую лабораторию поступил материал (ликвор) от больного с предположительным диагнозом: «Клещевой энцефалит». После выделения чистой культуры вируса осуществляется идентификация вируса в РН на мышах. Назовите ингредиентов и механизм реакции.
Задача 6. В лабораторию поступила сыворотка крови пациента переболевшего брюшным тифом. С помощью какой серологической реакции можно установить брюшнотифозное бактерионосительство? Назовите ингредиентов.
Задача 7. Выделить чистую культуру М.pneumoniae удается редко и не ранее через месяц. В связи с этим основным методом диагностики пневмоний является серодиагностика, которая осуществляется постановкой РСК. Назовите компонентов реакции.
Задача 8. При исследовании отделяемого зева больного выделена культура С.diphteriae. Какой метод следует применить для определения ее токсигенности? Назовите ингредиентов реакции.
Задача 9. Для уточнения диагноза заболевания больного с подозрением на бруцеллез необходимо использовать опсонофагоцитарную реакцию. Какие ингредиенты следует подготовить для ее постановки? Что такое опсонины, фагоцитарный показатель и опсонический индекс?
Задача 10. Какие ингредиенты необходимо подготовить для постановки непрямого способа ИФА с целью определения Т-хелперов?
Задача 11. У больного с хроническим сепсисом необходима оценка иммунологического статуса. Какие ингредиенты необходимо подготовить для постановки непрямого способа ИФА с целью определения В-лимфоцитов?
Задача 12. У ребенка 3 лет подозревают наличие иммунодефицитного состояния. Какие показатели будут использованы для оценки В-системы иммунитета и какие тесты будут включены в иммунологический анализ?
Задача 13. В лабораторию поступила кровь от больного брюшным тифом для постановки реакции агглютинации. Какие ингредиенты будут использованы для ее постановки? Какой показатель реакции будет использован в качестве диагностического?
Задача 14. Из испражнений больного выделена Е.сoli . Какие методики реакции агглютинации будут использованы для идентификации культуры?
Задача 15. В детском саду планируется ревакцинация детей против туберкулеза. Какую аллергическую пробу и с какой целью предварительно сделать детям? Какой препарат применяется для постановки пробы?
Задача 16. В лабораторию поступил материал (кожа из полушубка) для выявления возбудителя сибирской язвы. Какую серологическую реакцию следует применить для обнаружения антигенов возбудителя в исследуемом материале? Какие ингредиенты необходимо подготовить для ее постановки?
Задача 17. В лабораторию поступила кровь больного с подозрением на грипп. Для подтверждения диагноза необходимо поставить РСК. Какие ингредиенты необходимо подготовить для ее постановки? По какому признаку будете оценивать положительный или отрицательный результат реакции?
Задача 18. Выделена культура вируса гриппа А заражением в аллантоисную полость куриного эмбриона. Необходимо поставить РТГА с целью определения серотипа вируса гриппа. Какие ингредиенты необходимо подготовить для ее постановки? По какому признаку можно оценить результат реакции?
Задача 19. В лабораторию поступил смыв из носоглотки больного аденовирусной инфекцией. Необходимо поставить реакцию нейтрализации с диагностической целью. Какие ингредиенты необходимо подготовить для ее постановки? Оцените результат.
Задача 20. В детском садике планируется осуществить вакцинацию против дифтерии и столбняка АДС вакциной. Какую иммунологическую реакцию используют для определения напряженности поствакцинального иммунитета? Какие ингредиенты следует подготовить? Как оценивается реакция?
Задача 21. В лабораторию института вакцин и сывороток поступила противодифтерийная сыворотка для определения ее специфической активности. Какую реакцию следует использовать для этой цели? Какие ингредиенты следует приготовить для ее постановки?
Задача 22. В лабораторию поступила кровь от больного с подозрением на эпидемический сыпной тиф. При изучении ее в реакции агглютинации получен положительный результат (титр сыворотки 1:800). Антитела при сыпном тифе обнаруживаются с 5-6-го дня болезни, достигая максимума к 14-16-му дню и сохраняются в организме переболевших долгие годы.
Удалось ли поставить этиологический диагноз? Почему? Какие дополнительные исследования можно предложить?
Задача 23. У доярки совхоза при исследовании крови на наличие антител к бруцеллам обнаружен титр 1:200. Как доказать, больна ли доярка в настоящий момент или этот показатель – результат прививки?
Задача 24. В хирургическом отделении у больного развилось осложнение послеоперационной раны. Клинически была заподозрена газовая гангрена. Поставлена РНГА для обнаружения экзотоксина в крови больного. Какие ингредиенты необходимо подготовить для ее постановки?
Задача 25. В порт прибыл корабль с грузом из Африки. Карантинная служба порта обнаружила в трюмах трупы крыс. Укажите метод серологического исследования термоэкстракта трупного материала крыс. Предполагаемый диагноз чума.
Задача 26. Мужчина 40 лет обратился к врачу на 8- й день болезни. Несколько дней назад он купался в реке, выше по течению которой было место скота. Среди животных в данной местности регистрировались заболевания лептоспирозом. Врач заподозрил возможность лептоспироза. Для подтверждения диагноза необходимо поставить реакцию агглютинации - лизиса. Какие ингредиенты необходимо подготовить для ее постановки? По какому признаку будете оценивать положительный или отрицательный результат реакции? Как оценивается реакция? Назовите механизм реакции.
Задача 27. В одном из детских садов зарегистрированы случаи заболевания скарлатиной. Как проверить наличие антитоксического иммунитета к скарлатине у контактных детей? Какие ингредиенты необходимо подготовить для ее постановки?
Задача 28. Первые опыты по противотуберкулезной иммунизации были проведены Р. Кохом. Он многократно вводил туберкулин морской свинке, а затем и инфицировал ее микобактериями туберкулеза. Животное погибало от туберкулеза через 2-4 недели. Почему у животных отсутствовал иммунитет против туберкулеза?
ОТВЕТЫ НА СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ
1. РА на стекле капельным способом.
Компоненты: Выделенная чистая культура Sh.flexneri, диагностические монорецепторные сыворотки против 1 и 2 типов Sh.flexneri, физиологический раствор.
2. Отделяемое носоглотки, диагностические видоспецифические сыворотки (противогриппозная и противопарагриппозная), антиглобулиновая сыворотка, меченная флюорохромом; изотонический раствор хлорида натрия
3. Ig отдельных классов определяют с помощью ИФА. Гепатит А подтверждается у первого больного, так как Ig M является показателем активности инфекционного процесса.
4. Исследуемый вирус, диагностические типоспецифические сыворотки с антителами против трех серотипов вируса полиомиелита, тканевые культуры. Учет реакции проводится по отсутствии ЦПД на тканевой културе из-за нейтрализации патогенного свойства вируса специфическими антителами
5. Исследуемый вирус, диагностическая видоспецифическая сыворотка с антителами против вируса клещевого энцефалита, белые мыши для опыта и контроля (вирус без сыворотки). При положительной реакции мышка выживает из-за нейтрализации инфекционного свойства вируса гомологичными антителами.
6. Реакция пассивной Vi-гемагглютинации. Ингредиенты: сыворотка больного, эритроцитарный Vi-диагностикум (Vi - АГ S.typhi, адсорбированной на поверхности эритроцитов барана), физиологический раствор.
7. Сыворотка крови больного, диагностикум М.pneumoniae, сыворотка морской свинки (комплемент), эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, физиологический раствор.
8. РП в геле по Оухтерлони. Ингредиенты: выделенная чистая культура C.diphtheriae, полоска фильтровальной бумаги, пропитанной противодифтерийной антитоксической сывороткой, чашка Петри с питательной средой.
9. Ингредиенты: исследуемая сыворотка крови, суточная микробная культура, взвесь нейтрофилов (фагоцитов).
Опсонины – антитела (IgG, частично IgA), усиливающие фагоцитоз микробов. Роль опсонинов выполняют также компоненты комплемента, белки острой фазы, сурфактантные белки легких и другие факторы.
Фагоцитарный показатель – количество микробов, поглощенных одним нейтрофилом, определяют путем подсчета среднего количества фагоцитированных бактерий на один лейкоцит.
Опсонический индекс – фагоцитарный показатель иммунной (исследуемой) сыворотки / фагоцитарный показатель нормальной сыворотки.
Чем выше опсонический индекс (должен быть > 1), тем выше иммунитет.
10. Ингредиенты: плазма крови (взвесь лимфоцитов), моноклониалные антитела против CD3 клеток, антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой; субстрат для пероксидазы (ОФД), фосфатно-солевой буфер.
11. Ингредиенты: плазма крови (взвесь лимфоцитов), моноклониалные антитела против CD19-22 клеток, антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой; субстрат для пероксидазы (ОФД), фосфатно-солевой буфер.
12. Определение количества В-лимфоцитов методом ЕАС – розеткообразования (ЕАС-РОК), ИФА, ПЦ. Определение концентрации иммуноглобулинов в реакции преципитации по Манчини, ИФА. Определение продукции ИЛ-4, 5, 6 с помощью ИФА и проточной цитометрии.
13. Ингредиенты: сыворотка крови больного в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800; диагностикумы (S.typhi, S.P.A., S.P.B), физиологический раствор. Диагностический титр – 1:200, т.е. реакция считается положительной при наличии агглютинации в разведении сыворотки 1:200 и более. Обычно она наступает в больших разведениях. Если наблюдается групповая агглютинация с двумя или тремя антигенами, то учет реакции проводится по максимальному разведению сыворотки.
14. РА на стекле капельным способом. Положительная реакция подтверждается развернутой РА.
15. Перед вакцинацией ставится проба Манту с целью определения поствакцинального противотуберкулезного нестерильного иммунитета. Ревакцинации подлежат лица с отрицательной пробой Манту. Для постановки пробы применяются очищенный туберкулин (ППД-Л) – очищенный белок туберкулезной палочки.
16. РП по Асколи. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген - гаптен B. antanthracis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая противосибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
17. Ингредиенты: парные сыворотки крови (сыворотки, взятые в начале и конце заболевания), диагностикум вируса гриппа, комплемент (сыворотка морской свинки), гемолитическая сыворотка, 3% взвесь эритроцитов барана, физиологический раствор. При положительной реакции наблюдается гемагглютинация, при отрицательной - гемолиз эритроцитов (лаковая кровь). Диагностическое значение имеет четырехкратное увеличение титра антител во второй сыворотке.
18. Аллантоисная жидкость куриного эмбриона, диагностические противогриппозные типоспецифические сыворотки: А0, А1, А2; 5% взвесь куриных эритроцитов, физиологический раствор.
Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной – выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).
19. Смыв из носоглотки, диагностическая видоспецифическая сыворотка с антителами против аденовируса, индикатор реакции (тканевые культуры или эритроциты).При положительной реакции отмечается задержка цитопатогенного действия в культуре тканей или отсутствие гемагглютинации).
20. РПГА. Необходимые ингредиенты: испытуемая сыворотка в различных разведениях (1:10, 1::20, 1:40 и др); эритроцитарные диагностикумы (дифтерийный и столбнячный),физиологический раствор, контрольные сыворотки(противодифтерийная и противостолбнячная) с активностью 10МЕ/мл.
Учет реакции проводят по степени агглютинации эритроцитов. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде компактной точки или толстого кольца, при положительной - оседают в виде ровного слоя клеток с неровным краем (в виде зонтика).
Титром антитоксина в исследуемом материале считают последнее максимальное разведение, где еще наблюдается агглютинация.
21. Можно использовать реакцию флоккуляции. Ингредиенты реакции: противодифтерийная сыворотка в различных разведениях, дифтерийный анатоксин с активностью 1Lf, физиологический раствор.
Активность сыворотки выражается в МЕ/мл. (минимальное количество сыворотки, которое даёт интенсивную «инициальную» флоккуляцию с 1Lf анатоксина). Феномен флоккуляции – (помутнение) – внешнее проявление образования комплекса анатоксин + антитоксин в оптимальных количественных соотношениях ингредиентов.
22. Нет, т.к. реакция может быть положительной в 3-х случаях: у больных, переболевших и вакцинированных. Рекомендуется повторная постановка реакции через 10 – 14 дней для определения нарастания титра антител в 4 и более раза, что определяется только у больных.
23. Подтвердить диагноз можно с помощью ИФА определением противобруцеллезных IgM и IgG. IgM является показателем острого бруцеллеза.
24. Двухкратные разведения исследуемой сыворотки, эритроцитарный антительный диагностикум (эритроциты с адсорбированными антитоксинами к экзотоксинам соответствующих видов возбудителей газовой гангрены), физиологический раствор.
25. Реакция термокольцепреципитации по Асколи.
26. Ингредиенты реакции: исследуемая сыворотка крови в различных разведениях, живая лабораторная культура лептоспир, комплемент, физиологический раствор. Учет реакции проводят в препаратах «раздавленной» капли в темном поле или при фазово–контрастной микроскопии. Под воздействием противолептоспирозных бактериолизинов в присутствии комплемента лептоспиры теряют подвижность и распадаются.
27. Проверить наличие иммунитета к скарлатине у контактных детей можно с помощью РПГА.. Ингредиенты реакции: испытуемая сыворотка (разводят физ. раствором от 1:10 до 1:20480 в 12 лунках. полистероловой пластины), диагностикум скарлатинозный эритроцитарный (анатоксин Str.pyogenes , адсорбированный на поверхности эритроцитов), противодифтерийная контрольная сыворотка с активностью 10 МЕ/мл, физиологический раствор;
Титром антитоксина в исследуемом материале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитов.
28. Туберкулин применяется для постановки кожно-аллергической пробы с целью выявления специфической сенсибилизации к инфекционному аллергену, что возникает в результате текущего, перенесенного заболеваний, вакцинации или инфицирования. Для специфической профилактики применяется вакцина BCG.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов мед. вузов / под ред. А. А. Воробьева. – 2-е изд., испр. и доп. М. : МИА, 2012. – 702 с.
2. Коротяев А. И., Бабичев. С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед. вузов. СПб.: СпецЛит, 2010.
Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html.
3. В. В. Зверев, М. Н. Бойченко. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 1. М.:Гэотар Медиа, 2010.
Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html.
4. В. В. Зверев, М. Н. Бойченко. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс] : учебник: в 2 т. Т. 2. М.:Гэотар Медиа, 2010.
Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html.
5. Хаитов Р.М. Иммунология: учебник второе издание. - М.: Гэотар Медиа, 2011. – 312с.
6. Хаитов Р.М. Иммунология [Электронный ресурс]: учебник. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009.
Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970412220.html.
1. Л. В. Ковальчук, Г. А. Игнатьева, Л. В. Ганковская и др. Иммунология. Практикум. Клеточные, молекулярные и генетические методы исследования [Электронный ресурс]: учебное пособие. М.: Гэотар Медиа, 2010.
2. Р. М. Хаитов, А. А. Ярилин, Б. В. Пинегин Иммунология [Электронный ресурс]: атлас. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.
Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970418581.html
3. Е.Н. Медуницына, Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин. Методы диагностики в аллергологии и иммунологии [Электронный ресурс]. M.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.
Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/970409039V0001.html.
4. Н. Ф. Снегова, Р. Я. Мешкова, М. П. Костинов, О. О. Магаршак. Вакцинопрофилактика в аллергологии и иммунологии [Электронный ресурс]. M.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.
Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/970409039V0005.html.
Давлетшина Гульшат Кинзябулатовна
Габидуллин Зайнулла Гайнулинович
Ахтариева Айгуль Атласовна
Туйгунов Марсель Маратович
Булгаков Айдар Казбекович
Савченко Татьяна Алексеевна
Хуснаризанова Рауза Фазыловна
Габидуллин Юлай Зайнуллович
Алсынбаев Махамат Махаматуллович
Существуют две ветви приобретенного иммунитета с разным составом участников и различным предназначением, но имеющие одну общую цель - устранение антигена. Как мы увидим в дальнейшем, эти две ветви взаимодействуют друг с другом, чтобы достичь конечной цели - устранения антигена.
Из этих двух направлений приобретенного иммунного ответа одно определяется участием в основном В-клеток и циркулирующих антител, в форме так называемого гуморального иммунитета (термин «гуморальный» ранее использовали для определения жидких сред организма). Другое направление определяется участием Т-клеток, которые, как мы указывали ранее, не синтезируют антител, но синтезируют и высвобождают различные цитокины, действующие на другие клетки. В связи с этим данный вид приобретенного иммунного ответа называется клеточным или клеточно-опосредованным иммунитетом.
Гуморальный иммунитет
Гуморальный иммунитет определяется участием сывороточных антител, которые являются белками, секретируемыми В-клеточным звеном иммунной системы. Первоначально после связывания антигенов со специфическими молекулами мембранного иммуноглобулина (Ig) (В-клеточные рецепторы; В cell receptors - BCR) В-клетки активируются для секреции антител, которые экспрессируются этими клетками. По имеющимся оценкам, каждая В-клетка экспрессирует примерно 105 BCR совершенно одинаковой специфичности.После связывания антигена В-клетка получает сигналы на производство секретируемой формы того иммуноглобулина, который ранее был представлен в мембранной форме. Процесс инициации полномасштабной реакции с участием антител направлен на удаление антигена из организма. Антитела представляют собой гетерогенную смесь сывороточных глобулинов, которые обладают способностью самостоятельно связываться со специфичными антигенами. Все сывороточные глобулины со свойствами антител относят к иммуноглобулинам.
Все молекулы иммуноглобулинов имеют общие структурные свойства, которые позволяют им: 1) распознавать и специфически связываться с уникальными элементами структуры антигена (т.е. эпитопами); 2) выполнять общую биологическую функцию после соединения с антигеном. В основном, каждая молекула иммуноглобулина состоит из двух идентичных легких (L) и двух тяжелых (Н) цепей, связанных дисульфидными мостиками. Получающаяся в результате структура показана на рис. 1.2.
Рис. 1.2. Типичная молекула антитела, состоящая из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей. Выделены антигенсвязывающие участки
Часть молекулы, которая связывается с антигеном, является зоной, состоящей из терминальных участков аминокислотных последовательностей как на L-, так и на Н-цепях. Таким образом, каждая молекула иммуноглобулина является симметричной и способна связываться с двумя идентичными эпитопами, имеющимися на одной молекуле антигена или на разных молекулах.
Кроме различий между участками, связывающими антиген, у разных молекул иммуноглобулина имеются и другие различия, наиболее важные из которых касаются Н-цепей. Существует пять основных классов Н-цепей (называемых у, μ, α, ε и δ).
На основании различий в Н-цепях молекулы иммуноглобулина были разделены на пять основных классов: IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, каждый из которых характеризуется уникальными биологическими свойствами. Например, IgG является единственным классом иммуноглобулинов, пересекающим плацентарный барьер и передающим материнский иммунитет плоду, в то время как IgA - основной иммуноглобулин, обнаруживаемый в таких секретах желез, как слеза или слюна.
Важно отметить, что антитела всех пяти классов могут обладать совершенно одинаковой специфичностью по отношению к антигену (антигенсвязывающие участки), сохраняя в то же время различные функциональные (биологические эффекторные) свойства.
Связь между антигеном и антителом нековалентная, она зависит от множества относительно слабых сил, таких как водородные связи, вандерваальсовы силы и гидрофобные взаимодействия. Поскольку эти силы слабы, для успешного связывания антигена с антителом требуется очень близкий контакт на ограниченном участке, наподобие контакта ключа и замка.
Другим важным элементом гуморального иммунитета является система комплемента . Реакция между антигеном и антителом активирует комплемент, который составляют ряд сывороточных ферментов, что приводит или к лизису мишени, или усиливает фагоцитоз (поглощение антигена) клетками-фагоцитами. Активация комплемента также приводит к привлечению полиморфно-ядерных (ПМЯ) клеток , обладающих высокой способностью к фагоцитозу и являющихся частью врожденной иммунной системы. Эти события обеспечивают максимально эффективный ответ гуморальной ветви иммунитета на вторжение чужеродных агентов.
Клеточно-опосредованный иммунитет
Антигенспецифичная ветвь клеточно-опосредованного иммунитета задействует Т-лимфоциты (рис. 1.3). В отличие от В-клеток, вырабатывающих растворимые антитела, которые циркулируют для связывания соответствующих специфичных антигенов, каждая Т-клетка, несущая множество идентичных антигенных рецепторов, называемых TCR (около 105 на клетку), сама направляется непосредственно к месту, где на АПК экспрессируется антиген, и взаимодействует с ней в близком (непосредственно межклеточном) контакте.
Рис. 1.3. Рецепторы для антигена, экспрессируемые как трасмембранные молекулы на В- и Т-лимфоцитах
Существует несколько различающихся по фенотипу субпопуляций Т-клеток, каждая из которых может обладать одинаковой специфичностью по отношению к антигенной детерминанте (эпитопу), но при этом выполнять различные функции. В данном случае можно провести аналогию с разными классами молекул иммуноглобулинов, которые обладают одинаковой специфичностью, но различными биологическими функциями. Имеются две субпопуляции Т-клеток: Т-клетки-хелперы (Тн-клетки), которые экспрессируют молекулы CD4, и цитотоксические Т-клетки (Тс-клетки), которые экспрессируют молекулы CD8 на своей поверхности.
Разным субпопуляциям Тн-клеток приписывают различные функции.
- Взаимодействие с В-клетками для увеличения продукции антител. Такие Т-клетки действуют путем высвобождения цитокинов, которые обеспечивают подачу различных активирующих сигналов В-клеткам. Как указывалось ранее, цитокины являются растворимыми веществами или медиаторами, высвобождаемыми клетками; такие медиаторы, высвобождаемые лимфоцитами, называются лимфокинами. Группе цитокинов с низкой молекулярной массой дали название хемокины. Они, как указывается далее, участвуют в воспалительной реакции.
- Участие в реакциях воспаления. После активации определенная субпопуляция Т-клеток высвобождает цитокины, индуцируя миграцию и активацию моноцитов и макрофагов, что приводит к возникновению так называемых воспалительных реакций гиперчувствительности замедленного типа. Эту субпопуляцию Т-клеток, участвующих в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), иногда называют Тгзт или просто Тн.
- Цитотоксические эффекты. Т-клетки особой субпопуляции становятся цитотоксическими клетками-киллерами, которые при контакте со своей мишенью способны нанести удар, ведущий к гибели клетки-мишени. Эти Т-клетки называют цитотоксическими Т-клетками (Тс). В отличие от Тн-клеток они экспрессируют молекулы CD8 на своих мембранах и поэтому называются СD8+-клетками.
- Регуляторные эффекты. Хелперные Т-клетки могут быть разделены на две различные функциональные подгруппы в соответствии с цитокинами, которые они высвобождают. Как вы узнаете из следующих глав, эти субпопуляции (Тн1 и Тн2) обладают различными регуляторными свойствами, которые передаются посредством высвобождаемых ими цитокинов. Более того, Тн1 -клетки могут негативно перекрестно влиять на Тн2-клетки, и наоборот. У другой популяции регуляторных или Т-клеток-супрессоров отмечается коэкспрессия CD4 и CD25 (CD25 является α-цепью рецептора интелейкина-2. Регуляторная активность этих СD4+/СD25+-клеток и их роль в активном подавлении аутоиммунитета обсуждается в гл. 12.
- Эффекты цитокинов. Т-клетки и другие клетки иммунной системы (например, макрофаги) оказывают различное воздействие на многие клетки, лимфоидные и нелимфоидные, посредством разных цитокинов, которые они высвобождают. Таким образом, прямо или косвенно Т-клетки связываются и взаимодействуют с множеством типов клеток.
В результате многолетних иммунологических исследований было установлено, что клетки, активированные антигеном, проявляют целый ряд эффекторных способностей. Однако только за последние несколько десятилетий иммунологи стали осознавать всю сложность событий, которые происходят при активации клеток антигеном и при их взаимодействии с другими клетками. Мы теперь знаем, что простой контакт Т-клеточного рецептора с антигеном недостаточен для активации клетки.
В действительности для активации антигенспецифичной Т-клетки должны быть даны по крайней мере два сигнала. Первый сигнал обеспечивается связыванием Т-клеточного рецептора с антигеном, который должен быть соответствующим образом презентирован АПК. Второй сигнал определяется участием костимуляторов, среди которых имеются определенные цитокины, такие как IL-1, IL-4, IL-6, и поверхностные молекулы, экспрессированные на АПК, такие как CD40 и CD86.
В последнее время под термином «костимулятор» стали подразумевать и другие стимулы, например продукты жизнедеятельности микроорганизмов (инфекционные, чужеродные) и поврежденная ткань («гипотеза опасности» П. Матзингера (P. Matzinger)), которые будут усиливать первый сигнал, если он относительно слаб. Как только Т-клетки получают достаточно четкий сигнал для активации, происходит ряд событий, и активированная клетка синтезирует и высвобождает цитокины. В свою очередь эти цитокины контактируют с определенными рецепторами на различных клетках и воздействуют на эти клетки.
Хотя обе, гуморальная и клеточная, ветви иммунного ответа рассматриваются как самостоятельные и отличные друг от друга компоненты, важно понимать, что реакция на любой специфический патоген может предусматривать сложное взаимодействие между ними, а также участие элементов врожденного иммунитета. Все это нацелено на обеспечение достижения максимально возможного выживания организма за счет удаления антигена и, как мы увидим далее, защиты организма от аутоиммунного ответа на собственные структуры.
Проявление разнообразия в иммунном ответе
Последние достижения в иммунологических исследованиях обусловлены союзом молекулярной биологии и иммунологии. Благодаря тому что клеточная иммунология смогла выявить на клеточном уровне суть многочисленных и различных по спектру реакций, а также природу процессов, позволяющих достичь уникальной специфичности, появилось множество соображений относительно реальных генетических механизмов, которые позволяют всем этим специфичностям стать частью репертуара у каждого представителя данного вида.Вкратце эти соображения таковы:
- По различным подсчетам число специфичных антигенов, к которым может возникать иммунный ответ, способно достигать 106-107.
- Если каждый специфичный ответ, как антительный, так и Т-клеточный, определяется одним геном, означает ли это, что каждому индивидууму потребуется более 107 генов (один на каждое специфичное антитело)? Каким образом этот массив ДНК передается неповрежденным от индивида к индивиду?
Природа создала технологию генных рекомбинаций, при которой белок может кодироваться молекулой ДНК, составленной из набора рекомбинируемых (переставляемых) мини-генов, которые и составляют полный ген. На основе небольшого набора таких мини-генов, способных свободно комбинироваться для создания целого гена, можно получить огромный репертуар специфичностей, используя ограниченное число генных фрагментов.
Первоначально этот механизм был призван объяснить существование огромного разнообразия антител, которые не только секретируются В-клетками, но также фактически составляют антиген-или эпитопспецифичные рецепторы В-клеток. Впоследствии было установлено, что подобные механизмы отвечают и за разнообразие антигенспецифичных Т-клеточных рецепторов (TCR).
Достаточно сказать, что существование различных методов молекулярной биологии, позволяющих не только исследовать гены, но и произвольно перемещать их из одной клетки в другую, обеспечивает быстрый дальнейший прогресс в иммунологии.
Р.Койко, Д.Саншайн, Э.Бенджамини
А. Исследование гуморального иммунитета
1. Определение числа B-лимфоцитов. На клеточной мембране лимфоцитов находится множество гликопротеидов, которые можно обнаружить при проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител. Некоторые из этих гликопротеидов специфичны для определенного типа клеток, например T-, B- и NK-лимфоцитов, разных субпопуляций T-лимфоцитов, моноцитов, и даже для определенных стадий их созревания и дифференцировки. Эти молекулы принято обозначать CD. В настоящее время определены функции многих CD (см. табл. 18.8). При оценке результатов исследования необходимо учитывать возраст больного. Кроме того, необходимо постоянно контролировать качество реактивов и соблюдение методики, поскольку даже незначительное ее нарушение искажает результаты исследования. Определение B-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии основано на выявлении иммуноглобулинов, фиксированных на поверхности клеток, CD19 и CD20 (см. табл. 18.8). У детей старшего возраста и взрослых B-лимфоциты составляют 10-20% всех лимфоцитов крови, у детей младшего возраста их больше.
2. Определение титра антител. При подозрении на недостаточность гуморального иммунитета оценивают титр антител к белковым и полисахаридным антигенам. Обычно их определяют после вакцинации или инфекции.
а. Антитела к белковым антигенам. В большинстве случаев исследуют IgG к дифтерийному и столбнячному анатоксинам до и спустя 2-4 нед после вакцинации АКДС или АДС. Поскольку почти все взрослые вакцинированы АКДС, уровень антител после ревакцинации служит показателем вторичного иммунного ответа. Можно определить также антитела к антигену PRP после введения вакцины против Haemophilus influenzae типа B. Хотя этот антиген представляет собой полисахарид, в конъюгированной вакцине он действует как белковый антиген. Иногда исследуют антитела после иммунизации инактивированной вакциной против полиомиелита и рекомбинантной вакциной против гепатита B. При подозрении на иммунодефицит живые вирусные вакцины противопоказаны.
б. Антитела к полисахаридным антигенам. Для оценки гуморального иммунного ответа на полисахаридные антигены применяются пневмококковая и менингококковая вакцины, не содержащие белковых носителей. Титр антител определяют до и спустя 3-4 нед после вакцинации. В некоторых исследовательских лабораториях для этих целей используют неконъюгированную вакцину против Haemophilus influenzae типа B. Результаты оценивают с учетом возраста больного. Так, у детей младше 2 лет иммунный ответ на полисахаридные антигены слабый, у некоторых детей он остается таковым вплоть до 5 лет. В связи с этим применение полисахаридных вакцин у детей младшего возраста нецелесообразно и даже противопоказано, поскольку может привести к иммунологической толерантности и неэффективности ревакцинации в более старшем возрасте.
в. Оценка первичного и вторичного гуморального иммунного ответа. Для определения клиренса антигена, уровня IgM (при первичном иммунном ответе) и IgG (при вторичном иммунном ответе) в качестве белкового антигена используют бактериофаг фихи 174 - бактериальный вирус, безопасный для человека. Для оценки первичного гуморального иммунного ответа применяют также гемоцианин брюхоногих моллюсков, рекомбинантную вакцину против гепатита B, мономерный флагеллин, вакцину против клещевого энцефалита.
г. Естественные антитела (изогемагглютинины, антитела к стрептолизину O, гетерофильные антитела, например антитела к эритроцитам барана) в норме присутствуют в сыворотке почти всех людей. Это объясняется тем, что антигены, против которых направлены эти антитела, широко распространены и содержатся в пищевых продуктах, вдыхаемых частицах, микрофлоре дыхательных путей.
3. Определение подклассов IgG. Если при рецидивирующих бактериальных инфекциях дыхательных путей общий уровень IgG в норме или незначительно снижен или выявляется изолированный дефицит IgA, показано определение подклассов IgG. При этом можно обнаружить дефицит IgG 2 (IgG 2 составляет около 20% IgG), который может быть изолированным или сочетаться с дефицитом IgA или IgG 4 . Следует помнить, что функциональная оценка гуморального иммунного ответа - более информативный метод исследования, чем количественное определение подклассов IgG. Так, при нормальном уровне IgG 2 часто бывает снижен уровень антител к полисахаридным антигенам Streptococcus pneumoniae. Наряду с этим возможен врожденный дефицит IgG 2 , обусловленный нарушением синтеза тяжелых цепей, в отсутствие каких-либо клинических проявлений иммунодефицита.
4. Определение IgA. Изолированный дефицит секреторного IgA при нормальном уровне IgA в сыворотке встречается редко. Как правило, наблюдается одновременный дефицит секреторного и сывороточного IgA. Изолированный дефицит IgA клинически не проявляется или сопровождается легкими инфекциями верхних дыхательных путей. Это обусловлено тем, что при дефиците IgA компенсаторно повышается уровень IgG в сыворотке и IgM в секрете слизистых. Уровень IgA измеряют в слезе, слюне и других биологических жидкостях. Существует два подкласса IgA - IgA 1 и IgA 2 . В крови и секрете дыхательных путей преобладает IgA 1 , в секретах ЖКТ - IgA 2 . Нормальные показатели уровней IgA 1 и IgA 2 .
5. Синтез иммуноглобулинов in vitro. Это исследование позволяет оценить выработку IgM, IgG и IgA стимулированными B-лимфоцитами. Смешивая обработанные разными стимуляторами T- и B-лимфоциты здоровых и больных, можно оценить функцию T-хелперов и B-лимфоцитов. В большинстве случаев дефицит антител обусловлен нарушением дифференцировки B-лимфоцитов в плазматические клетки.
6. Биопсию лимфоузлов при подозрении на первичный иммунодефицит, как правило, не производят. Она показана лишь в тех случаях, когда диагноз неясен и у больного увеличены лимфоузлы, что требует исключения гемобластоза. Биопсию обычно производят через 5-7 сут после антигенной стимуляции. Антиген вводят в область, лимфа от которой оттекает в группу лимфоузлов, один из которых подлежит биопсии. При недостаточности гуморального иммунитета в лимфоузле снижено число плазматических клеток, количество первичных фолликулов увеличено, вторичные фолликулы отсутствуют, толщина коркового вещества уменьшена, наблюдается перестройка ткани лимфоузла, иногда увеличивается число макрофагов и дендритных клеток.
1. Методы первого уровня основаны на доказательстве взаимодействия в системе антиген-антитело. Положительные результаты свидетельствуют о специфичности реакций. В принципе можно выделить три типа реакций:
Тест конъюгации. При этом маркируют один из реагентов, результаты оценивают по его связыванию с другими реагентами на основании физических или химических свойств конъюгата (прямая иммунофлюоресценция, иммунопероксидазный метод, ауторадиография);
Тесты, основанные на изменении свойств одного из реагентов (например, изменение флюоресценции, электрического потенциала, вязкости раствора; синтез соединений с более высокой молекулярной массой, изменение ферментативной активности антигенов). Эти тесты обладают ограниченными возможностями;
Тесты, основанные на отделении комплекса антиген-антитело от несвязанных реагентов с помощью техники высаливания, преципитации, использования специфических антител или адгезии на клеточной поверхности. К ним следует отнести большинство радио- и иммуноферментных методов.
2. Методы второго уровня основаны на более сложном характере взаимодействия между антигеном (поливалентным) антителом (по меньшей мере двухвалентными антителами). При этом механизмы преципитации, агглютинации и т. д., лежащие в основе комплекса, в большей степени, чем при методах первого уровня, зависят от рН, ионной силы и других условий реакции. Поэтому положительные результаты не всегда определяют степень выраженности реакции антиген-антитело, а отрицательные еще не означают отсутствия этой реакции. Тем не менее, среди методов этой группы можно отметить и такие иммунологические тесты, которые имеют особое значение для клинической практики.
К методам второго уровня относятся следующие реакции: преципитация, агглютинация, реакция связывания комплемента. Промежуточное положение между методами первого и второго уровней занимают исследования на изолированных клетках, например цитолиз или феномен освобождения медиаторов с участием эозинофилов.
Реакции, основанные на феномене агглютинации . В отличие от реакции преципитации при агглютинации антиген представлен в корпускулярной форме (прямая агглютинация эритроцитов или бактерий) либо связан на частицах носителя (непрямой вариант, пассивная агглютинация). Механизм агглютинации изучен еще не полностью. Согласно одной из теорий, главная роль принадлежит специфической адсорбции антител на поверхности клеток, что приводит к снижению поверхностного потенциала или повышению гидрофобных свойств мембраны. В пользу этой теории свидетельствует тот факт, что агглютинация, как и преципитация, в значительной мере зависит от присутствия микроколичеств электролитов. Согласно другой концепции, а это соответствует теории «решетки» Marrack, агглютинация происходит при условии, если один активный центр двухвалентного антитела соединяется с одной антигенной детерминантой, а второй активный центр - с другой детерминантой. Избыток или недостаток антител приводит к торможению агглютинации. Хотя такие свойства, как размеры частиц и структура Ig, вносят коррективы в интерпретацию данных, тем не менее важные аргументы свидетельствуют в пользу этой теории.
Подобно преципитации данный метод используют как полуколичественный анализ, с помощью которого определяют то максимальное разведение сыворотки, при котором еще возможна агглютинация. Результаты можно оценивать макроскопически. Чувствительность агглютинации значительно варьирует при использовании разных систем антиген-антитело. Кроме того, агглютинация - это более чувствительный метод, чем реакция преципитации (почти в 103 раз). При оптимальных условиях удалось выявить антитела с минимальной концентрацией да 0,05 мл. Ig известных классов обладают разными агглютинационными свойствами. Так, способность к агглютинации молекул IgM в 60-180 раз выше, чем молекул IgG.
Прямая реакция агглютинации происходит при условии, если антиген является элементом клеточной мембраны или присутствует на поверхности других частиц (эритроцитов, бактерий, частиц пыльцы). Постановка этой реакции осуществляется как в пробирках (тогда результаты оценивают после седиментации), так и в лунках, расположенных на специальной пластине. В частности, определение группы крови человека - это общепринятый экспресс-метод, также основанный на феномене агглютинации. Для идентификации группы крови каплю суспензии эритроцитов смешивают с каплей стандартной агглютинирующей сыворотки определенной специфичности: при положительной реакции агглютинаты видны уже макроскопически, если реакция отсутствует, то суспензия эритроцитов сохраняет гомогенность.
Антиглобулиновый тест (реакция Кумбса). Антиглобулиновый тест служит для доказательства присутствия в сыворотке неагглютинирующих или «неполных» антител. Наиболее часто этот метод используют при диагностике болезней крови, обусловленных иммунным гемолизом. Первоначально исследователи применяли антиглобулиновую сыворотку (против глобулина человека), однако позднее было установлено, что она реагирует с компонентами комплемента. В настоящее время вместо нее интенсивно внедряют моноспецифические антисыворотки против определенных классов Ig (моноклональные антитела). Прямой вариант теста служит для обнаружения связанных с клеткой «неполных» антител; при непрямом варианте выявляют циркулирующие антитела: исследуемую сыворотку предварительно инкубируют с эритроцитами, а затем воспроизводят прямой тест. Разработана постановка антиглобулинового теста в комбинации с пассивной гемагглютинацией для выявления как неагглютинирующих аутоантител, так и реагинов. И, наконец, непрямая техника флюоресценции - это также одна из модификаций антиглобулинового теста.
Тест потребления антиглобулина (тест Штеффена). Следует обратить внимание на этот метод, хотя в данном случае мы имеем дело лишь с индикаторной реакцией. С помощью этого теста можно выявить антитела к антигенам клеток тканей, клеточных ядер или нерастворимых элементов тканей. Определить эти антитела с помощью реакции агглютинации невозможно. При непрямом варианте теста антигены (гомогенизированные ткани) инкубируют с исследуемой сывороткой, а затем тщательно отмывают для удаления несвязанных антител. Далее с этим гомогенатом инкубируют антиглобулиновую сыворотку с заранее известным титром. В результате происходит потребление антиглобулина антителами, адсорбированными на тканях. В соответствии с этим титр антиглобулиновой сыворотки снижается. Уровень исследуемых антител до и после инкубации определяют с помощью индикаторной системы, состоящей из сенсибилизированных неполными антителами эритроцитов, поэтому данный вариант можно рассматривать как модификацию реакции торможения гемагглютинации. При постановке прямого варианта теста предварительную инкубацию с исследуемой сывороткой не производят.
Данный метод применяют для определения аутоантител при ревматоидном артрите , антител к ДНК при системной красной волчанке , а также для доказательства выработки антител к антигенам на лейко- и тромбоцитах. Метод зависит и от многочисленных неспецифических факторов - вот почему особую важность приобретают соответствующие способы контроля. При интерпретации результатов не следует забывать, что общепринятая техника может демонстрировать связывание глобулинов, не всегда обусловленное комплексом антиген-антитело.
Реакция связывания комплемента . Это непрямой метод для выявления антител или антигенов. Реакция основана на том, что комплемент принимает участие в многочисленных реакциях типа антиген-антитело. Постановку опыта осуществляют в два этапа: на I этапе исследуемую сыворотку и известный антиген инкубируют с комплементом, на II - готовят индикаторную систему, состоящую из гемолитической сыворотки и эритроцитов, и добавляют к смеси реагентов. Если I этап опыта завершается реакцией антиген-антитело, то происходит связывание комплемента, при этом гемолиз индикаторных эритроцитов отсутствует или выражен незначительно. Если в исследуемой системе не образуется комплекс антиген-антитело, то комплемент полностью включается в индикаторную систему, что приводит к гемолизу. В качестве источника комплемента обычно служит свежая сыворотка крови морской свинки. Ее комплемент реагирует с антителами всех видов млекопитающих. В индикаторной системе используют, как правило, эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к эритроцитам барана.
Реакция иммунного гемолиза и цитотоксический тест . Иммунный гемолиз может служить доказательством, с одной стороны, активности комплемента, с другой - цитотоксического эффекта антител к эритроцитам, поэтому указанные реакции важны для иммуногематологической диагностики. Пассивную гемагглютинацию можно преобразовать в реакцию пассивного гемолиза, при этом смесь реагентов должна состоять из антител, эритроцитов, нагруженных соответствующим антигеном, и комплемента.
Цитологический тест информативен при изучении патогенетических механизмов. Тем не менее возможности его использования довольно ограничены, учитывая сложность методов клеточного культивирования. Цитотоксические реакции могут быть опосредованы антителами (активация комплемента), клетками-киллерами и сенсибилизированными Т-лимфоцитами.
Тест нейтрализации . Принцип теста состоит в том, что определенные биологические свойства антигена нейтрализуются при воздействии антител. Наиболее широко его применяют для выявления антитоксических (столбняк , дифтерия) и антивирусных антител.
Прочие методы . Кроме методов, ранее описанных в отдельных главах (анафилаксия in vitro по Шульцу-Дейлу, освобождение гистамина из базофильных гранулоцитов и тучных клеток, кожные пробы, «разрешающая» доза аллергена как тест оценки иммунного ответа, пассивная кожная анафилаксия и реакция Прауснитца-Кюстнера), следует назвать способы доказательства продукции IgE, диагностические тесты для анализа иммунных комплексов, методы выявления аутоантител при аутоиммунных заболеваниях.
