Иммунология. Неспецифические факторы защиты организма. Защита от инфекции

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

Рис. 2. РА на стекле.

На предметное стекло наносят каплями:

1 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3 -ья капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий . Перемешивают.

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа.

2. Учет результатов РНГА , поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками . Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет зонтик пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция преципитации – это формированиеи осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

3. Постановка и учет реакции кольцепреципитации для определения видовой принадлежности кровяного пятна.

Постановка . В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой против белков крови человека в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна ). В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков барана, в пробирку №3 - физиологический раствор (контроль) и добавляют также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Учет . Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.

4. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре .

Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой . После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная, должна быть заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид «стрел-усиков », которые хорошо видны в проходящем свете.

Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА ) выявления титра специфических антител у больного.

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик ), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител - 1:100.

6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр ). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками:++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение , в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

Теоретические основы иммунохимического анализа (ИХА) опираются на современную иммунохимию, знание физико-химических закономерностей иммунных реакций, а также основные принципы аналитической химии.
Иммунохимический анализ - метод определения веществ, основанный на использовании высокоспецифической и высокочувствительной реакции обратимого связывания антигена (Аг) со специфическими антителами (Ат):
(2.41)
(2.42)
где Ат (антитела) - защитные белки, вырабатываемые организмом в ответ на введение чужеродных веществ с характерными химическими группировками; Кхи Кл- константы скорости образования и диссоциации иммунного комплекса Аг-Ат состава 1:1.
Антитела - специфические белки крови (иммуноглобулины), вырабатываемые организмом позвоночного животного или человека в ответ на введение чужеродных веществ. Эта реакция является защитной реакцией организма (проявлением иммунитета). Ат - наиболее универсальные биологические реагенты, которые могут обеспечить высокую селективность действия. По своему составу антитела являются гликопротеинами. Организм вырабатывает антитела против чужеродных антигенов, которые связываются с Аг и выводятся из организма в виде иммунных комплексов.
Антигены - вещества, которые индуцируют образование антител. Таким образом, организм защищается от веществ, попадающих в организм и несущих признаки генетической чужеродности. К антигенам относятся как высокомолекулярные соединения, такие как белки, полисахариды, липосахарцды, нуклеиновые кислоты (и в очищенном виде, и в виде компонентов различных биологических структур - клеток, тканей, вирусов и т.д.), так и различные низкомолекулярные соединения, многие из которых как раз и относятся к токсичным соединениям (например, пестициды).

Антитела можно получить практически к любому веществу. Низкомолекулярные вещества (молекулярная масса менее 1000 Да) не обладают антигенными свойствами, т.е. при попадании в организм не вызывают иммунного ответа и образования Ат. Для того чтобы стимулировать иммунный отклик, такие соединения должны быть ковалентно соединены с крупными молекулами (обычно белками), при этом получаются конъюгаты, которые используются для иммунизации животных. Вещества, которые сами по себе не вызывают иммунного ответа, но будучи конъюгированы с носителем, обладают способностью стимулировать синтез Ат против них, называются гап- тенами.
В качестве гаптенов могут выступать самые разнообразные органические соединения. С практической точки зрения важными являются стероидные и пептидные гормоны, широкий круг лекарственных соединений, пестициды, продукты промышленного органического синтеза, обладающие токсичным и аллергенным действием.
В настоящее время синтезированы высокомолекулярные соединения, не имеющие аналогов в природе, которые обладают способностью вызывать образование Ат (например, полимеры поливинил- пиридина с боковыми функциональными группами). Такие вещества получили название искусственных антигенов.
В принципе, иммунная реакция является обратимой и описывается теми же кинетическими и термодинамическими параметрами, что и любой процесс комплексообразования, в частности соответствующей константой - константой образования комплекса (Кл):
(2.43)
Как в живом организме, так ивне его Ат способны образовывать иммунные комплексы Аг-Ат преимущественно с комплементарным Аг, несмотря на присутствие большого числа других компонентов анализируемой пробы.
Первая стадия [уравнение (2.41)] иммунной реакции характеризует взаимодействие активного центра антител с антигенной детерминантой - эпитопом (т.е. участком антигена с определенными функциональными группами), вторая [уравнение (2.42)] - образование комплексов сложного состава, состоящих из разного количества молекул Аг и Ат. Распознавание чужеродных субстанций и специфическое реагирование на них выражается в нейтрализации, разрушении и выведении антигенов за счет образования белковых комплексов - это сущность иммунологических реакций.
Первоначально методы иммунохимического анализа были основаны на использовании преимущественно второй стадии, связанной с образованием видимого преципитата (осадка) или, например, с аг-
глютинацией эритроцитов. Для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Процесс носит качественный характер и не позволяет достичь необходимой чувствительности определений. Кроме того, преципитация непригодна для определения многих соединений (например, гормонов, лекарственных соединений, пестицидов).
Использовать первую стадию для анализа стало возможным тогда, когда в один из компонентов системы ввели маркер (метку), который легко детектируется каким-либо физическим методом. Тогда реакция описывается следующим образом:
(2.44а)
где Ат* - меченое антитело.
Отделив продукты реакции (2.44а) от исходных компонентов, можно найти концентрацию Аг-Ат* и по соответствующему градуировочному графику рассчитать содержание, например, Аг. При фиксированной концентрации антител равновесное отношение концентраций свободного и связанного антигена [Аг ]/ [Аг-Ат *] зависит от его общей концентрации ([Аг] + [Аг-Ат]). Это соотношение лежит в основе любого варианта иммунохимического анализа и позволяет определять неизвестную концентрацию антигена.
Весьма удобными для этих целей оказались такие «метящие» агенты, как радионуклиды, ферменты, флуоресцентные или хемилюминесцентные соединения, парамагнитные соединения, ионы металлов, бактериофаги, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимияеских методов в миллионы раз, а время определения Аг уменьшить до нескольких часов.
Многообразие меток определило и различие методов детекции образующихся комплексов, а также способов разделения комплексов и исходных веществ. Для выявления и количественного определения различных по природе биологически активных веществ в рассматриваемых вариантах анализа используются иммунологические принципы.
Несомненными достоинствами иммунохимических методов анализа являются высокая чувствительность и селективность, простота и экспрессность проводимых определений, возможность использования их вне лабораторных условий, несложная пробоподготовка и возможность автоматизации используемых процессов. Большинство иммунохимических методов не требует дорогостоящей аппаратуры, поскольку контроль за процессом образования иммунных комплексов основан на фотометрическом, флуориметрическом, люминесцентном или электрохимическом детектировании. Полуколичес-
таенную оценку можно проводить визуально, что позволяет разрабатывать диагностические иммунные тест-системы для экспрессного определения биологически активных соединений.
Следует отметить, что узкая специфичность И ХА в отдельных случаях может быть недостатком таких методов. К недостаткам можно отнести и возможность влияния матричных компонентов в определенных случаях.
Иммунологическая специфичность. Антитела, образующиеся в ответ на введение в организмы высших животных и человека генетически чужеродных веществ - антигенов, специфически взаимодействуют именно с этими антигенами, несмотря на присутствие множества других молекул. Уникальная специфичность и высокая чувствительность иммунохимических взаимодействий реализуется не только в организме (in vivo), но и, например, в пробирке (in vitro). Это и явилось причиной использования антител в качестве селективных биореагентов. Даже простейшие их молекулы имеют сложное строение. Схематически структура антител представлена на рис. 2.12.
Общей структурной единицей всех антител является комплекс из четырех полипептидных цепей - двух идентичных между собой лег-


Рис. 2.12. Схематичное изображение строения антител:
V - вариабельный участок, находящийся в N-концевой области полипептидной цепи; С - постоянный участок, расположенный в С-концевой области

ких цепей с молекулярной массой 20-25 тыс. каждая и двух идентичных тяжелых с молекулярной массой 50-55 тыс. Легкие цепи содержат около 220 аминокислот, тяжелые - 440-700 аминокислотных остатков.
Каждая из легких цепей прочно соединена с участками тяжелых цепей благодаря межцепочечным дисульфидным связям и множеству слабых гидрофобных, электростатических и других межатомных взаимодействий. Аналогичные связи существуют и между свободными участками тяжелых цепей. Структура такого комплекса напоминает латинскую букву «Y». В любой молекуле Ат обе легкие цепи, как и тяжелые, всегда идентичны друг другу и состоят из двух участков: вариабельного (V), находящегося в N-конце вой области полипептидной цепи, и постоянного (С), расположенного в С-кон- цевой области. Тяжелые цепи разных классов Ат имеют существенные различия в строении, тогда как легкие, являются общими для всех антител. Отличительные особенности между специфическими молекулами Ат выявляются только в пределах вариабельной области. Это связано с тем, что именно здесь локализованы аминокислотные остатки, которые участвуют в формировании активного центра молекулы Ат (антидетерминанты).
Начиная с 1964 г. Ат принято называть иммуноглобулинами. Была выявлена неоднородность иммуноглобулинов, что позволило выделить пять их основных классов - иммуноглобулины G (IgG), М (IgM), A (IgA), D (IgD) и Е (IgE).
Основная часть Ат состоит из мономерных белков с молекулярной массой 150 тыс. Да, получивших название IgG. Они являются в настоящее время наиболее изученным классом Ат. Концентрация IgG по сравнению с другими классами Ат в сыворотке крови особенно высокая и может составлять в среднем 12 г/мл.
К классу IgM относятся Ат с высокой молекулярной массой (900 тыс. Да) и высоким содержанием углеводов. Макромолекулы IgM включают преимущественно 5 мономерных субъединиц, связанных друг с другом дисульфидными связями. Концентрация Ат этого класса составляет примерно 10% от общего количества иммуноглобулинов.
Следующий класс иммуноглобулинов (IgA) также характеризуется высоким содержанием углеводов и встречается в большом количестве в секреторных жидкостях (слюна, слезы, молоко и т.д.). Биологическая функция IgA заключается в основном в местной защите слизистых оболочек от различных инфекций.
Концентрация IgD, являющихся мономерами, в сыворотке крови достигает в среднем 30 мг/л, 75% присутствует в плазме крови. Биологическая роль IgD до конца не выяснена, но установлено, что они выполняют роль рецепторов В-лимфоцитов.
Имуноглобулины Е термолабильны, представлены мономерами и принимают участие в протекании аллергических реакций. В норме концентрация IgE в сыворотке крови составляет в среднем 0,25 мг/мл. При аллергических же заболеваниях их содержание возрастает до 1,6 мг/мл.
Валентность молекулы Ат определяется числом антидетерминант. В молекуле IgG находятся, например, два идентичных антигенсвя- зывающих участка, поэтому такие Ат являются бивалентными.
Образование специфического комплекса Аг-Ат обеспечивается следующими связями: неполярное (гидрофобное) связывание, которое возрастает с
повышением температуры; ионные (кулоновские) взаимодействия; ван-дер-ваальсовы взаимодействия, действующие на малом
расстоянии; водородные связи; стерические силы отталкивания.
Считают, что наиболее существенную роль играют силы гидрофобного взаимодействия. Неполярное связывание возникает в результате стремления гидрофобных групп в водном растворе к ассоциации друг с другом, что сопровождается стабилизацией всей системы (уменьшением ее свободной энергии при одновременном увеличении энтропии).
Меньший вклад в связывание Аг с активным центром Ат вносят водородные и ионные взаимодействия. Водородные связи образуются при взаимодействии атома водорода, ковалентно связанного с каким-либо отрицательно заряженным атомом, с неподеленной парой электронов другого отрицательно заряженного атома. В реакции Аг с Ат в качестве таких групп обычно выступают аминогруппы и гидроксильные группы. Электростатические силы возникают при взаимодействии сильно заряженных ионизированных групп, таких как ионизированная аминогруппа (-NH3+) и ионизированная карбоксильная группа (-СОО).
Важным моментом в образовании прочных специфических комплексов является наличие множественных контактов, позволяющих, несмотря на слабость отдельных единичных взаимодействий, прочно удерживать Аг в антигенсвязывающей области активного центра Ат. Один и тот же Аг могут узнавать антитела, имеющие комплементарные ему структуры, но несколько отличающиеся по составу аминокислотных остатков в антигенсвязывающем центре. Химическая и пространственная комплементарность Ат обусловлена, с одной стороны, взаимодействием электронных облаков реагирующих химических групп, а с другой стороны - стерическими силами отталкивания. Кроме того, антигенсвязывающий центр молекулы Ат обла

дает в определенной степени способностью связывать антигены, отличные по структуре от основного. В этом случае в связывании принимает участие и часть общих аминокислотных остатков в анти- генсвязывающих центрах, отличающихся по своей локализации и природе. Совокупность указанных взаимодействий, накладывающихся друг на друга, определяет чрезвычайно сложный характер процессов, протекающих в комплексе Аг-Ат.
С количественной стороны прочность взаимодействия Аг-Ат характеризуется аффинностью, которая обусловлена связями между отдельными антидетерминантами и комплементарными детерминантами антигенов (или гаптенов).
Равновесная константа образования иммунокомплекса (Ка) также отражает специфичность и прочность связывания Аг-Ат (изменение свободной энергии системы при комплексообразовании):
(2.446)
(2.45)
Величина константы образования иммунных комплексов обычно составляет 106-1011 М*1, что соответствует изменению свободной энергии связывания в области -(24+52) кДж/моль. Если константа равновесия процесса комплексообразования больше 108, то антитела считаются высокоаффинными.
Если одна и та же популяция антител взаимодействует с двумя различными антигенами Аг, и Аг2 с константами комплексообразования Кх и К2, причем Кх » Kv то говорят, что данные антитела являются высокоспецифичными по отношению к Аг, и менее специфичными - к Аг2.
Совокупность всех этих факторов обеспечивает высокую устойчивость образующихся комплексов Аг-Ат и обусловливает способность Ат избирательно взаимодействовать только с определенным видом Аг (авидность). Именно эти свойства позволяют антителам участвовать лишь в определенных реакциях и выступать в этих случаях в роли аналитических реагентов. Их связывание с соответствующими антигенами прочнее и специфичнее, чем связывание большинства ферментов с субстратами. Часто они настолько селективны, что по-разному реагируют на два штамма одного и того же микроорганизма.
Поли- и моноклональные антитела. Поликлональными Ат являются антитела, вырабатываемые В-лимфоцитами животных в ответ на введение в организм чужеродных веществ. Такие Ат выделяют из сыворотки крови иммунизированных животных (антисыворотки),
и они представляют собой белки класса иммуноглобулинов, которые гетерогенны по своим физико-химическим свойствам - специфичности и аффинности. Поликлональные антисыворотки получают при иммунизации кроликов или овец. Антисыворотка, полученная таким образом, представляет собой смесь разных Ат в произвольных соотношениях. Это не позволяет в больших количествах нарабатывать стандартный препарат Ат.
Моноклональные Ат получают с помощью иммунной системы мышей и дальнейшего применения гибридомных технологий. Моноклональные Ат одинаковы по физико-химическим свойствам и специфичности. Такие Ат обеспечивают очень высокую специфичность и чувствительность, обусловленные тем, что клоны, дающие перекрестные реакции, отбрасывают на ранних стадиях скрининга. Моноклональные Ат могут быть наработаны гибридомными клетками в неограниченном количестве, что зависит лишь от времени жизни клетки.
Получение поликлональных Ат проще, быстрее и дешевле, поэтому на первом этапе исследования обычно используют поликлональные Ат. Полученные антисыворотки характеризуются концентрацией Ат, титром, эффективностью и специфичностью связывания с Аг.
Титр поликлональных Ат определяют как конечное разведение антисыворотки, которое еще позволяет связываться с Ат определенному количеству меченого Аг (обычно это 50%). Титр может достигать значений 1/10 000-1/100 000. Чем больше титр, тем меньшее количество антисыворотки необходимо для проведения ИХА.
В последнее десятилетие проявляется все больший интерес к новому классу материалов - полимерам с молекулярными отпечатками, что связано с наличием в их составе высокоспецифичных центров связывания, комплементарных по размеру, форме, структуре и физико-химическим свойствам определенным органическим молекулам. Такие полимеры получают полимеризацией специальных мономеров в присутствии определяемого вещества. Затем это соединение удаляют. Получающиеся полимеры содержат полости, способные специфически включать в себя именно то вещество, которое использовали для получения полимера с молекулярными отпечатками. Такие полимеры называют иногда синтетическими антителами.
Как следует из вышесказанного, Ат достаточно доступны, могут выступать как природный инструмент распознавания и выделения анализируемого соединения. Для проведения иммуноанализа требуются такие малые количества Ат, что антисыворотки, полученной от одного кролика, достаточно для проведения более чем 5 млн проб.
Антигены и гаптены. Антигены - это чужеродные агенты (клетки, вещества), которые при попадании в организм высших животных и человека способны, с одной стороны, вызывать иммунный ответ за счет образования специфичных Ат, а с другой стороны, образовывать иммунный комплекс и выводиться из организма.
Молекулы антигена имеют многочисленные детерминанты-эпитопы, именно к ним и вырабатываются специфические Ат. Антигены также характеризуются определенным строением активного центра. Способность избирательно реагировать с Ат определяет специфичность антигена, а способность вызывать иммунный ответ - характеризует его иммуногенность. Специфичность Аг выражается в том, насколько точно антигенная детерминанта вписывается в активный антигенсвязывающий центр антитела (антидетерминанты) и определяется набором детерминант, от числа которых зависит валентность Аг. Обычно, чем больше молекула Аг, тем выше его валентность. Характер связей зависит от количества детерминант (активных центров), которые имеет каждый конкретный антиген - их может быть две, три или шесть. Как правило, антигены, имеющие большую молекулярную массу, обладают большим количеством детерминант, поэтому они поливалентны.
Низкомолекулярные вещества (с молекулярной массой менее 1000), как правило, не обладают антигенными свойствами. Они могут проявлять специфичность, так как способны представлять собой отдельную антигенную детерминанту, но не обладают иммуно- генностью. Однако к этому классу веществ относится большинство лекарственных препаратов, гормонов, олигосахариды и олигонуклеотиды, а также различные экотоксиканты), поэтому необходимость их определения очевидна. Для того чтобы стимулировать иммунный ответ, такие вещества - гаптены - ковалентно связывают с молекулами белка (альбумином сыворотки крови человека, овальбумином, тироглобулином, бычьим сывороточным альбумином или синтетическим пептидом типа полилизина) и полученным конъюгатом иммунизируют животных. Такие соединения (конъюгаты) уже обладают способностью вызывать иммунный ответ.
В основе взаимодействия Аг (и гаптенов), перекрестно реагирующих с Ат, лежит структурное подобие или полное сходство с детерминантами специфического Аг. Комплементарная специфичность Аг обычно выше, чем перекрестно реагирующего структурного аналога.
Многие гаптены, входящие в состав модифицированных Аг, даже меньше отдельной детерминанты, но представляют собой иммуно- доминантную часть целой детерминанты, которая может включать также участок белковой молекулы-носителя или фрагмент химического вещества, с помощью которого осуществляется превращение гаптена в Аг (например, прикрепление гаптена к белку).

Основой любого иммунологического метода является искусственное воспроизведение реакции Аг-Ат в исследуемой пробе. При этом возможны два способа выполнения реакции: в пробу предположительно содержащую Ат, вводят искусственно полученные специфичные к ним Аг и затем определяют наличие иммунного комплекса; в пробу предположительно содержащую Аг, вводят искусственно полученные специфичные к ним Ат и затем определяют наличие иммунного комплекса.
При проведении таких реакций осуществляется принцип взаимодействия «ключ-замок», тогда можно определить тот или другой компонент соответствующих иммунологических реакций (рис. 2.13). Таким образом, можно выявить наличие, например, антигенов в объектах окружающей среды.

Рис. 2.13. Принцип взаимодействия компонентов иммунологических
реакций «ключ-замок»

Существующие методы иммунохимического анализа (ИХА) можно разделить на несколько групп.
К первой группе относятся методы анализа, основанные на взаимодействии Аг и Ат, результаты которого определяются непосредственно - визуально или с помощью приборной регистрации. Это методы преципитации и агглютинации в различных вариантах.
Ко второй группе относятся индикаторные методы с использованием специально приготовленных меченых молекул Ат или Аг, которые являются индикаторами (маркерами) образующихся иммунных комплексов.
Третью группу методов составляют методы, основанные на использовании иммуносенсоров, являющихся разновидностью биосенсоров.

Иммунологические реакции можно классифицировать на четыре типа, исходя из видов участвующих в них антител и модулирующих реакцию клеток, характера антигенов и длительности реакции. Иммунная реакция является очень сложной, с внутрисистемными ауторегуляторными связями на разных уровнях, хотя отдельные реакции обычно классифицируются как функционально разобщенные. Так, одно и то же лекарственное средство (например, пенициллин) у разных больных может вызвать иммунологические реакции как первого, так и второго или третьего типа. Некоторые чрезмерной силы ответные реакции были отнесены к реакциям гиперчувствительности потому, что они приводили к разрушению или повреждению тканей хозяина . Несмотря на это, классификация Gell и Coombs продолжает служить основой для понимания патологической физиологии и того спектра иммунологических реакций, которые практический врач видит в клинике . В табл. 2 приведена характеристика четырех типов иммунологических реакций.
Тип I. Примером реакции первого типа являются анафилактические реакции, которые называются также реакциями гиперчувствительности немедленного типа. Реакция вызывается антителом типа IgE, прикрепляющимся к поверхности тучных клеток и базофильных нейтрофи-

Таблица 2. Классификация иммунологических реакций и Coombis (1975)

Цитотоксическая
реакция
Иммунный комплекс
Г иперчувствитель- ность замедленного типа, клеточноопосредованный иммунитет
Реакция антиген - IgE происходит на поверхности тучных клеток и базофилов с высвобождением медиаторов
Реакция IgG, IgM с антигеном происходит на клеточных мембранах, активируется комплемент, высвобождаются анафилатоксины, разрушаются клетки
IgE и IgM реагируют с антигеном независимо от фиксации и откладываются в микрососудах, комплемент активируется, клетки разрушаются
Не участвуют Специализированные Т-лимфоциты реагируют с антигенами, высвобождаются лимфокины
Анафилаксия Волдыри и эритема на коже
Экзогенная астма
Трансфузионные реакции
Г емолитическая анемия
Резус-конфликт
Сывороточная болезнь Г ломерулонефрит
Контактный дерматит Туберкулиновая реакция

лов; Если к такому прикрепленному антителу IgE присоединится антиген, то активация и дегрануляция клетки приведут к высвобождению различных фармакологически активных веществ, вызывающих классическую анафи- лаксию\ (гл. 2). Однако не все аллергические реакции первого типа являются анафилактическими. К первому типу относятся классическая картина аллергии на введение пенициллина, реакции на пчелиный яд, экзогенно-аллергическая астма и аллергический ринит. Вообще к первому типу относятся все аллергические реакции .
Тип II. Реакции второго типа известны как цитоток- сические реакции. В них участвуют антитела типа IgG или IgM, называемые цитотоксическими антителами. Реакции этого типа возникают тогда, когда антитела соединяются с иммуноспецифическими антигенами. В роли антигенов могут выступать сложные компоненты клеточных мембран (антигены групп крови) или молекулярные компоненты, известные как гаптены, адгезирующие- ся к поверхности эритроцитов (например, пенициллин). Взаимодействие антигена с антителом активирует систему комплемента, которая в свою очередь лизирует клетки. Во время активации комплемента высвобождаются фрагменты пептидов - анафилатоксины, которые вызывают системные реакции. К реакциям второго типа относятся, например, посттрансфузионные реакции на основе несовместимости крови по системе АВО, гемолитическая болезнь новорожденных, аутоиммунные и гемолитические анемии, а также синдром Гудпасчера.
Тип III. Реакции третьего типа известны как реакции иммунных комплексов. Антитела и циркулирующие растворимые антигены образуют нерастворимые комплексы, слишком маленькие для того, чтобы удаляться макрофагами ретикулоэндотелиальной системы печени и селезенки. Вместо этого комплексы откладываются в микроцир- куляторном русле. В реакции участвуют антитела класса IgG или IgM. Взаимодействие антигена с антителами активирует комплемент, вследствие чего возникает воспалительный процесс, локализующийся вокруг отложенных комплексов. Освобожденные анафилатоксины вызывают также миграцию других воспалительных клеток и возникновение васкулита. Механизм повреждения ткани состоит в опосредованном комплементом привлечении к месту фиксации иммунных комплексов полиморфноядерных лейкоцитов. Классическим примером аллерги
ческой реакции III типа является так называемая сывороточная болезнь, возникающая после повторного введения чужеродных иммунных сывороток при змёиных укусах и ботулизме или антилимфоцитарного глобулина. Примерами реакций третьего типа являются такжеваску- литы, возникающие после введения пенициллина, и лекарственная системная красная волчанка.
Тип IV. Реакции четвертого типа известны как клеточно-опосредованные иммунные реакции или реакции гиперчувствительности замедленного типа. Эти реакции не зависят от наличия антител. Вместо выработки антител клеточные антигены или внутрисосудистые протеины активируют лимфоидные клетки, известные как тимусзави- симые лимфоциты. Активированные Т-клетки могут непосредственно убить чужеродные клетки или продуцировать особые вещества - лимфокины, которые организуют иммунный ответ. Лимфокины опосредуют возникновение воспаления на месте расположения чужеродного антигена. Они регулируют действия макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов и других клеток, убивающих чужеродные клетки и организмы. Развитие реакций идет медленно; они появляются только через 18-24 ч, достигают максимума к 48 ч и исчезают через 72-96 ч.
Примерами клеточно-опосредованных иммунных ответов могут служить кожная туберкулиновая проба, отторжение трансплантата, аллергия к сумаху укореняющемуся.
Отклонения клеточно-опосредованной иммунной функции вызывают недостаточность системы нормального иммунного надзора, вследствие чего больные подвергаются риску инфекции, вызванной условно-патогенными возбудителями. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) является манифестацией отклонений в системе клеточно-опосредованных иммунных реакций. Субпопуляции Т-лимфоцитов, известных как цитотоксические клетки-супрессоры, при инфицировании вирусом иммунодефицита человека (HTVL-III) претерпевают изменения, вследствие чего развивается СПИД. На фоне такого иммунодефицита могут проявляться инфекции, вызванные условно-патогенными возбудителями (например, Pneumocystis carinii) и лимфопролиферативные синдромы (например, саркома Капоши).

Содержимое статьи:

Иммунная система человека – это целостный взаимосвязанный механизм, который имеет ряд биологических и физических особенностей. Иммунная система организма состоит из органов, тканей и клеток, обеспечивающих специфические условия защиты от воздействия чужих тел. Реакция специфической защиты отличается высокими показателями и способна идентифицировать конкретный возбудитель. Таким образом, специфическая защита организма проявляется с помощью множественных действий, которые направлены на противостояние с инородными агентами.

Составляющие иммунной системы

В состав иммунной системы человека входят центральные органы:

• костный мозг;
• тимус.

Кроме того, периферические органы:

• селезёнка;
• лимфатические узлы;
• лимфатические фолликулы ЖКТ.

Эти органы вырабатывают разные виды клеток и обеспечивают стабильный и постоянный контроль за состоянием клеточного и антигенного воздействия на общее внутреннее состояние организма. Центральные органы отвечают за выработку и созревание лимфоцитов.

Понятие клеточной иммунной реакции

Клеточную реакцию иммунитета на чужеродные возбудители обеспечивают Т-лимфоциты, принимающие участие в защитных реакциях организма по двум направлениям. С одной стороны – приходят на помощь, когда В-лимфоцитам необходимо распознать чужеродное тело и стимулировать его к выработке сложных молекул антитела. С обратной стороны – Т-лимфоциты в процессе антигенной реакции имеют способность самостоятельно растворять и убивать инородные тела напрямую. При первом взаимодействии Т-лимфоцита с инородным агентом происходит целый ряд сложный реакций – сенсибилизация. В процессе этих реакций Т-лимфоциты получают способность различать антигены от различных других инородных тел и способствовать выработке реакции на эти возбудители. В процессе взаимодействия антигенов и лимфоцитов появляются два вида Т-лимфоцитов: лимфоциты-киллеры, способные разрушать инородные тела, и лимфоциты Т-клетки памяти, которые хранят память о вражеских нападениях и «следят» за организмом в случае повторного воздействия.

Специфические факторы защиты организма

Специфическая защита организма препятствует любому чужеродному проникновения антител. Это целый комплекс, включающий в себя различные формы и факторы, с помощью которых иммунная система вырабатывает реакцию на возбудителя. К ним относятся:

• образование антител;
• иммунный фагоцитоз;
• киллерная способность лимфоцитов;
• аллергическая реакция;
• иммунологическая память;
• иммунологическая толерантность.

Антитела проявляют значимую роль в процессе формирования инфекционного иммунитета и общей защиты организма. Они образуются в организме с помощью стороннего возбудителя путём инфицирования, а также с помощью вакцинации живыми вакцинами. Иммунный фагоцитоз – это поглощение инородных веществ клетками-фагоцитами. Сами по себе они очень подвижны, имеют способность самостоятельно передвигаться по направлению к возбудителю. Этот процесс в медицине носит название хемотаксис. Как правило, процесс фагоцитоза заканчивается тогда, когда клетки «сообщают» организму об окончании захвата и переваривания инородных тел.

Специфические факторы защиты организма – это огромное количество взаимосвязанных комплексов, которые направляются на избавление от отдельных антигенов. При проникновении в тело инородный организм начинает процесс размножения и привлекает к себе внимание «родных» клеток иммунной системы. Такие виды клеток известны тем, что они способны распознавать разные виды антигенов и применять методы, которые окажутся наиболее эффективными для борьбы с ними. В целом, весь процесс, который приводит к иммунному ответу, длится от 7 до 14 дней. По истечению этого срока плазмоциты начинают активно вырабатывать антитела. В свою очередь, они проникают в кровь, лимфу, жидкость тканей и продолжают расходиться по организму.

Антитела – универсальные виды белков, которые наделены способностью взаимодействовать с определёнными антигенами. Таким образом, все антитела имеют способность уничтожать инородные микроорганизмы и подавлять их деятельность, уничтожать чужеродные клетки и препятствовать действию токсичных веществ.

Антитела способны вырабатываться конкретно против того антигена, который проникает в организм. Несмотря на то, что все антитела имеют общую структуру, они способны оказывать разное воздействие на очаги поражения:

• агглютинины – склеивают антигены;
• преципитины – оседают на антигенах;
• лизины – разрушают инородные клетки.

Однако в медицине известны случаи, когда не все чужеродные агенты и инородные тела можно распознать, и, более того, уничтожить в процессе фагоцитоза. В основном, такие методы подходят для борьбы с вредными веществами и микробами, но практически бессильны перед вирусами. Это объясняется тем, что вирусы проникают непосредственно в клетки организма, где и происходит их развитие. Клетки фагоцитоза и антитела не могут обезвредить вирусы, которые «спрятались» внутри клеток. Поэтому, чтобы разобраться с вирусами, нужно уничтожать и сами клетки, в которых они размещаются. С этой функцией отлично справляются Т-лимфоциты-киллеры. Они обладают уникальной способностью распознавать и уничтожать клетки, заражённые вирусами, а также попутно убивать клетки, поражённые дефектом (например, опухоли). На данном этапе происходит процесс общего действия иммунно компетентной клетки-киллера и антигена.

Процесс защиты

Таким образом, на протяжении определённого периода времени иммунный ответ организма развивается и набирает силу. В то время, когда «враг» начинает отступать, реакцию иммунной защиты необходимо срочно остановить, так как организм не должен зря растрачивать силы. За этот процесс отвечают Т-супрессоры. Если бы такие клетки отсутствовали в организме, процесс иммунной реакции и специфической защиты организма был бы очень сложным.

Некоторые из клеток организма, которые отвечают за специфическую защиту, имеют способность не только распознавать, но и откладывать в памяти конкретные виды антигенов. Такие компоненты иммунной памяти имеют продолжительность жизни более 25 лет. С их помощью борьба с инородными телами протекает намного быстрее и эффективнее. Бывает, что организм ещё не успел получить вред, а «врагам» уже был дан отпор. Такая реакция иммунного ответа носит название «вторичной».

Виды иммунитета

Иммунитет человека, следовательно, защита его организма, может быть двух видов – врождённой (неспецифической) и приобретённой (специфической). Из двух видов в постоянной активности находится только один – врождённый. Благодаря ему при любом инородном вмешательстве организм незамедлительно реагирует и проявляет специфическую защиту. Специфическая иммунная реакция – второй по продолжительности этап защитной реакции. Таким образом, он развивается куда более медленными темпами.

Активация приобретённого иммунитета проявляется в повышении температуры тела и общей слабости организма, так как все силы организм расходует на борьбу с чужеродными возбудителями. Именно повышенная температура пагубно влияет на возбудителей разных заболеваний, приводит к стимулированию различных обменных процессов в организме и повышает активную деятельность клеток иммунной системы человека. Как раз эти факторы влияют на то, что не рекомендуется сбивать различными медикаментозными препаратами температуру при болезни, если она ниже 38°С.

Два вида иммунитета по своей деятельности опираются на клеточные и гуморальные факторы, которые в свою очередь тесно взаимодействуют и работают по чётко налаженной схеме.

Реакции иммунитета

Реакции между антителами и антигеном, происходящие в организме, называют серологическими. К особенностям антител относят аффиность и авидность. Все иммунные реакции, происходящие в организме человека, имеют широкое применение в современной медицине для диагностических и иммунологических исследований. Серологические исследования также применяются для идентификации антигенов микробов, выявления и определения группы крови, исследования злокачественных и доброкачественных опухолевых образований.

Понятие аллергии

Как и любой механизм, организм человека иногда может давать сбои. К примеру, у некоторых людей может возникать чрезмерно повышенная чувствительность на определённые группы веществ. Как правило, такие вещества не представляют реальной угрозы для организма человека, но в процессе их проникновения в организм человека возникает сильный иммунный ответ. Такого рода реакция называется аллергией, а вещества, которые приводят к её появлению – аллергенами. Ими могут выступать компоненты бытовой пыли, шерсть животных, цветочная пыльца, пищевые красители и продукты с высоким содержанием неприемлемых для организма веществ, средства бытовой химии, косметика и т.д.

Аллергия часто сопровождается повышенной чувствительностью, которая проявляется в виде кашля, насморка, слезоточивости, высыпаний на коже. В индивидуальных случаях аллергия может представлять особую опасность для организма и даже заканчиваться летальным исходом. Некоторые симптомы аллергии очень схожи с признаками инфекционных заболеваний, поэтому точную клиническую картину может обрисовать только профессиональный доктор.

Защита от инфекции

Самый простой путь предотвратить попадание инфекции и простимулировать специфические факторы защиты организма – предотвратить попадание раздражителя в организм человека. Главным барьером в таком случае служит кожа. Находясь в нормальном неповреждённом состоянии, она становится непроницаемой для подавляющей части инфекционных возбудителей. Ко всему этому, большинство бактерий не могут долгое время существовать на кожном покрове. Это объясняется тем, что на коже регулярно выделяется молочная кислота и жирные вещества, вырабатываемые вместе с потом и секрецией сальных желез. В такой атмосфере бактерии не могут выживать долгое время.

Что касается внутренних органов человека, то проникновение бактерий и чужеродных тел происходит по альтернативной схеме. На внутренних стенках органов выделяется специфическая слизь, которая действует, как определённый барьер для защиты возбудителя инфекции. Таким образом, бактерии не могут присоединиться к клеткам эпителия. Если микробы всё же попали в организм, действует природный процесс – реснички эпителия приводятся в движение за счёт кашля или чихания, и прикреплённые микробы удаляются самостоятельно. Также существует ряд других факторов, которые способны уберечь поверхность эпителия от воздействия микробов, например, регулярное выделение мочи, слюны или слёз.

Специфические факторы защиты иммунитета человека – совершенный механизм защиты от агрессии, вызванной инородными биологическими возбудителями, который развивался в ходе эволюции и подразумевает под собой распознавание самых незримых отличий между инородными агентами. Современные представления о структуре, деятельности и функциях специфической системы напрямую связаны с понятием иммунной защиты организма человека.

Заключение

Таким образом, рассмотрена сложно устроенная специфическая защита организма, состоящая из сотен отдельных факторов, которые тесно взаимосвязаны между собой. В целом, процесс защиты организма осуществляется путём объединения двух важных этапов – распознавания и уничтожения чужеродных тел и молекул. Это достигается благодаря динамичной и слаженной работе иммуноцитов всевозможного предназначения. Нарушение хотя бы одного составляющего этапа этих процессов приводит к возникновению разного рода патологии, которые могут быть опасными для организма.

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ , основаны на взаимодействии антигена и находящегося в иммунной сыворотке антитела (согласно представлениям Эрлиха) или антигена и специфически измененной под влиянием иммунизаторного раздражения сыворотки (согласно новейшим воззрениям). Важнейшие И. реакции-аглютинация, преципитация, бактериолиз, реакция отклонения комплемента, реакция, основанная на действии опсонинов. Аглютинация и преципитация происходят при встрече антигена и соответствующего антитела; для осуществления бактериолиза, реакции отклонения комплемента и др. требуется помимо антигена и антитела также участие комплемента. Значение И. реакций двоякое. С их помощью можно ставить диагноз той или иной заразной болезни, приводя в соприкосновение сыворотку больного с микробом, возбудителем предполагаемой инфекции (реакция Видаля при брюшном тифе и парати-фах, реакция отклонения комплемента при различных инфекциях). С другой стороны, имея сыворотку, иммунную к определенной инфекции, возможно идентифицировать микроб, природа к-рого неизвестна. Преципитация имеет значение также в сан.-гиг. и суд.-мед. практике, позволяя определять видовую принадлежность животного, к которому относится исследуемый материал.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:
1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:
- оптимального соотношения АГ и АТ;
- степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);
- концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).