Определение резус-принадлежности крови. Поверхностные антигены клеток крови

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител

Введение

Гелевая технология в микропробирках (ГТМ) была предложена Y. Lapierre в 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле "сефадекс", помещенном в микропробирки. Обычно система представляет собой пластиковые карты, содержащие микропробирки, заполненные гелем (патент DiaMed AG, Швейцария). Иммуногематологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, обычно проводятся в жидкофазных системах.

Одним из наиболее важных условий получения корректных данных реакции агглютинации является оценка результата. Слабая реакция может быть неверно интерпретирована, особенно неопытным персоналом. Ложные слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста могут иметь место за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов. Неадекватное перемешивание эритроцитов и элюция слабофиксированных антител в процессе отмывания могут стать причиной ошибок при проведении непрямого антиглобулинового теста.

Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). Центрифугирование в геле может быть конечной фазой любых серологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, кроме методов, требующих диспергирования для оценки результата.

Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые варианты антигенов), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.

Принцип гелевого теста

Забуференный декстрановый гель Sephadex ТМ G 100 superline может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками - в отличие от стандартных серологических методик - с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. После инкубации следует центрифугирование в строго определенном режиме. Если условия центрифугирования не выполняются (центрифугирование недостаточно длительное или слишком мягкое) могут иметь место ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты также могут иметь место при нарушении условий (форсировании) центрифугирования. Использование автоматической ID-центрифуги (ДиаМед) устраняет эти проблемы. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

1. нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым, и ферментным методами, холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);
2. специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл и т.д.)
3. антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста (реакции Кумбса) при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером частиц геля и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще - положительный результат.

Фиксированная агглютинация в геле позволяет легко оценивать результат реакции, а наличие контрольной микропробирки в диагностической карте подтверждает достоверность полученных данных.

В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:

• сильноположительный (++++) - образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;
• положительный (+++) - агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;
• слабоположительный (++) - агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;
• очень слабоположительный (+) - агглютинаты располагаются в нижней трети геля;
• отрицательный (-) - эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.

Оборудование и реактивы

• ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;
• ID-центрифуга для центрифугирования карт;
• термостат на +37°С;
• штатив для пробирок и карт;
• пробирки вместимостью 5 и 10 мл;
• пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);
• перчатки резиновые хирургические;
• раствор для разведения 1 (раствор бромелина);
• раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы - LISS, РНИС);
• 0,9% раствор хлорида натрия;
• стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

Характеристика идентификационных карт

Идентификационные карты (ID-карты) Диа-Мед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля и антисывороток. Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (сtl). Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например: А-В-АВ-D-СDЕ-сtl или С-с-Е-е-К-ctl. Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты "Coombs / Enzyme Test": в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические - к иммуноглобулинам различных классов) - реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде.

Общие правила использования идентификационных карт

1. Идентификационные карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18-25°С. Срок годности указан в паспортной части каждой карты и на упаковочных коробках.
2. Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандартные сыворотки и стандартные ID-эритроциты, использующиеся в отдельных исследованиях, должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-8°С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке.
3. Во избежание получения ложных результатов исследований, запрещается использование любых реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа или при повреждении оболочки.
4. Заготовка крови осуществляется с применением современных флеботомических методик, а также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь. Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах.

Типирование антигенов эритроцитов

ID-карты ДиаМед предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая их слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов. ID-карты ДиаМед можно использовать взамен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, реагентами анти-D, анти-DСЕ, цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D и анти-D Супер.

• [показать] .

  Начальный этап выполняется по-разному, в зависимости от вида используемых ID-карт, содержащих поликлональные (см. ниже п.1а) или моноклональные (см. п. 16) антитела:

  1а) Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения ICID-карты, содержащие поликлональные антитела) для чего:

  • выдержать Раствор для разведения 1 до достижения им комнатной температуры;
  • приготовить 5% суспензию исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения 1, поместив в пробирку 0,5 мл Раствора для разведения 1 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы;
  • аккуратно смешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре;
  • использовать не позднее 15 мин после инкубации.

  16) Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения 2 (ID-карты, содержащие моноклинальные антитела) для чего:

  • выдержать Раствор для разведения 2 до достижения им комнатной температуры;
  • промаркировать чистые пробирки;
  • приготовить 5% суспензию исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения 2, поместив в пробирку 0,5 мл Раствора для разведения 1 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы.
• Дальнейшие действия [показать] .
  1. Промаркировать ID-карту (N исследуемого образца сыворотки или Ф.И.О. пациента).
  2. Снять защитную фольгу с пробирок ID-карты.
  3. В каждую пробирку ID-карты внести по 10 мкл исследуемых эритроцитов, приготовленных в соответствии с п.1а, или по 50 мкл исследуемых эритроцитов, приготовленных в соответствии с п.16.
  4. Установить ID-карты в ротор ID-центрифуги (с обязательным уравновешиванием другими ID-картами, возможно, неиспользованными).
  5. Центрифугировать ID-карты (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически).
  6. Оценить результат исследования: Результат в контрольной микропробирке - "ctl" - должен быть всегда отрицательным. Положительная реакция в "контроле" может быть вызвана присутствием аутоантител и неспецифическими плазменными белками. Если "контроль" положителен - определение недостоверно, его необходимо повторить после однократного отмывания образца эритроцитов 0,9% раствором хлорида натрия или Раствором для разведения 2.
  7. Результаты определения каждого антигена внести в соответствующую графу ID-карты (на белом поле внизу под каждым антигеном).
  8. Идентифицировать результат по следующей схеме (табл. 18.7-18.9)

  Таблица 18.7. Результаты исследования антигенов группы крови АВО и резус-принадлежности в ID-карте АВО/Rh
  Выявляемые антигены					Заключение
  А	В	АВ	D	СDЕ
  +	+	+	+	+	АВ Rh+
  +	+	+	-	-	АВ Rh-
  +	-	+	+	+	А Rh+
  +	-	+	-	-	А Rh-
  -	+	+	+	+	В Rh+
  -	+	+	-	-	В Rh-
  -	-	-	+	+	0 Rh+
  -	-	-	-	-	0 Rh-
  Примечание: Специфичность исследования подтверждается по отрицательному результату в пробирке с контролем ID-карты.

  Таблица 18.8 Определение антигенов эритроцитов системы АВО
  Группа крови
  	анти-А	анти-В	анти-АВ
  0(1)	-	-	-
  А1(II)	++++	-	++++
  А2(II)	++++	-	++++
  А3(II)	++/+++	-	++/++++
  А x (II)*	-/++	-	+/++
  В(II)	-	++++	++++
  В3(III)	-	+/+++	+/+++
  В x (III)*	-	-/++	-/++
  А1В(IV)	++++	++++	++++
  А2В(IV)	+++/++++	++++	++++
  Примечание : * - определение очень слабых вариантов антигенов А и В требует дальнейших исследований.

  Таблица 18.9 Определение резус-принадлежности (D, СDЕ)
  Резус-принадлежность	Результаты исследования с сыворотками
  	Анти-D	Анти-СDЕ
  D-положительная	++++	++++
  D-отрицательная	-	-
  D-отрицательная, С	Е- положительная*	-
  Слабоположительная (D u)	от ± до +++	от +++ до ++++
  Примечание : * - Положительная реакция с сывороткой анти-СDЕ при отрицательной реакции с сывороткой анти-D свидетельствует о наличии антигенов С, Е и требует дальнейшего типирования с использованием ID-карт: С-с-Е-е-К-сtl или С-С w -с-Е-е-К

Используемые ID-карты

При определении групп крови и резус-принадлежности применяют поликлональные (табл. 18.10 [показать] ) и моноклональные (табл. 18.11 [показать] ) реагенты. Наиболее частое применение на практике вследствие экономической целесообразности находят моноклональные сыворотки.

По современной классификации лица с ослабленным вариантом антигена D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z антигена D. Лица категории VI (резус-отрицательные реципиенты, но резус-положительные доноры!) могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Для подтверждения группы крови используют различные ID-карты: D(IV -) - для реципиентов, D(IV +) - для доноров.

Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или перекрестная реакция) (табл. 18.12 [показать] ).

Для углубленного обследования используют другие карты (табл. 18.13-18.14 [показать] ).

Выявление антиэритроцитарных антител

Принцип метода

Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления антител добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и центрифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглютинатов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроциты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активность и оценивается от ++++ до +.

• Алгоритм проведения исследований [показать] .

  Типированные эритроциты перед исследованием необходимо предварительно дважды отмыть от консерванта 0,9% раствором хлорида натрия, а затем выполнить следующие действия:

  • выдержать Раствор для разведения 2 до достижения комнатной температуры;
  • промаркировать пробирки;
  • приготовить 0,8% взвесь типированных эритроцитов в Растворе для разведения 2, поместив в пробирку 1,0 мл Раствора для разведения 2 и 10 мкл крови;
  • снять защитную фольгу с ID-карты;
  • промаркировать ID-карту (номер исследуемого образца сыворотки или Ф.И.О. пациента);
  • добавить по 50 мкл стандартных эритроцитов в микропробирки;
  • добавить по 25 мкл сыворотки или плазмы исследуемого образца в каждую микропробирку;
  • инкубировать 15 мин при температуре +37"С;
  • центрифугировать ID-карты в ID-центрифуге (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически).

  Примечание: стандартные эритроциты панели ID-DiaCell I-II-III и ID-DiaCell I-Ii-III P фирмы DiaMed готовы к применению без предварительного отмывания и обработки Раствором для разведения 2.

• Интерпретация результатов [показать] .

  Положительная реакция означает наличие в исследуемом образце иммунных антител.

  Если имеет место положительная реакция со всеми эритроцитами панели ID-DiaCell, рекомендуется выполнять аутоконтроль для исключения аутоантител в исследуемом образце.

  Если с одним или более видом эритроцитов панели ID-DiaCell реакция остается отрицательной, специфичность антител может быть установлена с помощью сопроводительного листа - таблицы антигенных профилей, прилагаемой ко всем упаковкам ID-DiaCell. При этом необходимо убедится в том, что номера панели ID-DiaCell1 и сопроводительного листа совпадают.

  Если данная панель не позволяет установить специфичность антител, рекомендуется продолжить идентификацию, используя расширенную панель эритроцитов ID-DiaРanel и/или ID-DiaРanel Р (в зависимости от первоначально использованной методики).

Скрининг и идентификация антител

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент (табл. 18.15-18.16 [показать] ). В первом случае для исследования используются обработанные ферментом эритроциты, во втором - суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и идентификация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста для скрининга и идентификации антител была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.

Методы исследования антител к антигенам эритроцитов

• Антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса) [показать] .

  Непрямой антиглобулиновый тест (НАТ) используется для выявления антиэритроцитарных антител. Обычно НАТ выполняется в два этапа:

  1. инкубация эритроцитов и сыворотки (фиксация антител) с последующим отмыванием для удаления несвязавшихся глобулинов; постановка непрямого антиглобулинового теста в гелевом тесте не требует отмывания эритроцитов!
  2. инкубация отмытых эритроцитов с античеловеческим глобулином (АЧГ). Агглютинация свидетельствует о наличии в сыворотке антител, связавшихся с антигенами эритроцитов in vitro.

  НАТ используется для:

  1. определения в сыворотке реципиента антител к эритроцитам донора - при постановке пробы на совместимость;
  2. при скрининге "неожиданных" антиэритро-цитарных антител;
  3. при исследовании антиэритроцитарных антител у беременных;
  4. при исследовании антител в сыворотке больных аутоиммунной гемолитической анемией.

  Ход определения:

  • внести в три расположенные слева пробирки ID-карты по 50 мкл взвеси типированных эритроцитов;
  • добавить в пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;
  • центрифугировать ID-карты в течение 10 мин;
  • оценить результат исследования. Вписать полученный результат в ID-карту.

  Результаты определения:

  • положительный результат свидетельствует о наличии иммунных (алло) антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используется таблица, прилагаемая к стандартным эритроцитам);
  • отрицательный результат свидетельствует об отсутствии иммунных антител в исследуемой сыворотке или плазме.
• Ферментный метод [показать] .

  Обработка протеолитическими ферментами повышает агглютинабельность эритроцитов.

  Ход определения:

  • внести в расположенные справа три пробирки ID-карты по 50 мкл взвеси стандартных типированных эритроцитов;
  • добавить в пробирки по 25 мкл Раствора для разведения 1;
  • добавить в пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки.

  Примечание: Раствор для разведения 1 не добавляется, если для исследования используются стандартные типированные эритроциты, предварительно обработанные протеолитическим ферментом (например, ID-DiaCell I-II-III P фирмы DiaMed).

  • инкубировать в течение 15 мин при температуре +37°С;
  • центрифугировать ID-карты в Ш-цент-рифуге в течение 10 мин (параметры установлены автоматически);
  • вписать полученный результат в ID-карту.

  Результаты исследования:

  • положительный результат свидетельствует о наличии аллоантител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используется таблица, прилагаемая к стандартным эритроцитам);
  • отрицательный результат свидетельствует об отсутствии аллоантител в исследуемой сыворотке или плазме.
• Метод холодовой агглютинации [показать] .

  Ход определения:

  • выдержать Раствор для разведения 2, типированные эритроциты и ID-карты в течение 30 мин при температуре 2-8°С;
  • обработать типированные эритроциты Раствором для разведения 2, для чего:
    • промаркировать пробирку;
    • приготовить 0,8% взвесь типированных эритроцитов в Растворе для разведения 2, поместив в пробирку 1,0 мл Раствора для разведения 2 и 10 мкл крови.

  Примечание: стандартные эритроциты ID-DiaCell (фирмы DiaMed) готовы к использованию и не требуют разведения;

  • внести в три расположенные справа пробирки ID-карты по 50 мкл взвеси типированных эритроцитов, обработанных Раствором для разведения 2;
  • добавить в эти пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;
  • инкубировать в течение 30 мин при температуре 2-8 С;
  • центрифугировать ID-карты в ID-центрифуге в течение 10 мин (параметры установлены автоматически);
  • оценить результат исследования;
  • вписать полученный результат в ID-карту. Результаты исследования:
  • положительный результат свидетельствует о наличии холодовых антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используется таблица, прилагаемая к стандартным эритроцитам);
  • отрицательный результат свидетельствует об отсутствии холодовых антител в исследуемой сыворотке или плазме.

  При наличии в исследуемой сыворотке холодовых или тепловых аутоантител могут наблюдаться ложноположительные результаты. Для исключения их необходимо поставить аутоконтроль:

  • приготовить 0,8% взвесь эритроцитов исследуемой крови в Растворе для разведения 2, добавив к 1,0 мл Раствора для разведения 2 10 мкл цельной крови;
  • внести по 50 мкл приготовленной взвеси эритроцитов в пробирку ID-карты, расположенную слева (для реакции Кумбса), или в пробирку ID-карты, расположенную справа (для ферментного метода и холодовой агглютинации);
  • в пробирки ID-карты внести по 25 мкл исследуемой сыворотки (для ферментного метода необходимо внести в пробирки еще по 25 мкл Раствора для разведения 1);
  • карты инкубировать 15 мин при температуре +37°С (для реакции Кумбса и ферментного метода) или при температуре 2-8°С (для постановки аутоконтроля холодовой агглютинации).

  Положительный результат в аутоконтроле свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке аутоантител.

Определение совместимости крови донора и реципиента

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвращение трансфузий гемокомпонентов, несовместимых по антигенам эритроцитов. Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора - наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического типа. Проведение такой пробы позволяет:

1. подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;
2. выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора.

Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов(табл.18.17 [показать] ) не заменяет обязательное имуногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и идентификацию аллоантиэритроцитарных антител), а лишь дополняет его.

Ввиду того, что сенсибилизация может появиться даже после трансфузий индивидуально подобранных гемокомпонентов, для проведения проб на совместимость необходимо использовать каждый раз свежую сыворотку пациента, полученную после последней трансфузии гемокомпонентов.

Проба на совместимость должна быть проведена для каждого образца крови донора!

• Ход определения [показать]
  • выдержать Раствор для разведения 2 до достижения комнатной температуры (20-24°С);
  • промаркировать ID-карты и пробирки (Ф.И.О. донора и реципиента);
  • приготовить 0,8% суспензию эритроцитов донора и реципиента в Растворе для разведения 2 для чего в две маркированные пробирки внести по 1 мл Раствора для разведения 2, добавить по 10 мкл крови донора и реципиента, соответственно;
  • смешать;
  • снять защитную фольгу с соответствующей ID-карты;
  • добавить по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов донора в микропробирки ID-карты 1, 2, 3, 4, 5;
  • добавить по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов реципиента в микропробирки ID-карты 4, 5, 6;
  • добавить по 25 мкл сыворотки или плазмы реципиента в микропробирки ID-карты 1, 2, 3, 6;
  • добавить 25 мкл Раствора для разведения 1 в микропробирку ID-карты 4 (ферментный тест);
  • инкубировать 15 мин при температуре +37°С;
  • центрифугировать (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически);
  • оценить результат исследования. Совместимость по антигенам А, В, D (1, 2, 3 микропробирки):
  • четкий положительный или отрицательный результат указывает на соответствие антигенов А, В, О эритроцитов крови донора и реципиента;
  • если наблюдается двойная популяция эритроцитов (в одной микропробирке положительный и отрицательный результат) антигены А, В, D донора и реципиента не идентичны!
  • определение совместимости по антигенам А, В, D действительно только при отрицательной реакции в 6-ой микропробирке (аутоконтроль).
• Результаты пробы на совместимость (4, 5 микропробирки) [показать]
  • положительный результат в микропробирках ID-карт 4, 5 при отрицательном контроле (микропробирка 6) свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов;
  • отрицательный результат в микропробирках ID-карт 4, 5, 6 свидетельствует о совместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов;
  • положительная реакция в микропробирке ID-карты 6 (аутоконтроль) требует дальнейшего определения ауто- и аллоантител в сыворотке (плазме) реципиента.
• Ограничения [показать]
  • определенные лекарственные средства могут вызывать ложноположительную реакцию Кумбса;
  • при некоторых патологических состояниях у больных может наблюдаться положительная реакция Кумбса;
  • бактериальное или другое загрязнение используемого материала может вызывать ложноположительный или ложноотрицательный результат;
  • остатки фибрина в исследуемых образцах могут связывать неагглютинированные клетки и после центрифугирования образовывать тонкую розовую линию на поверхности геля, тогда как большинство клеток будет локализовано на дне микропробирки;
  • суспензии эритроцитов, имеющие чрезмерную концентрацию, могут вызывать ложноположительные реакции.
• Условия хранения и эксплуатации [показать]

  ID-карты ДиаМед должны храниться при комнатной температуре (+18-25°С) в сухом помещении в течение всего срока годности.

  Срок годности карт - 18 месяцев. Срок годности реагентов - 2 года.

  Результаты исследования на карте сохраняются в неизменном виде:

  • 48 ч при комнатной температуре;
  • три недели в холодильнике (при +2-8°С) при заклеенной липкой лентой верхней части ID-карты.

  Нижнее поле ID-карты можно отклеить или отрезать и использовать как документ в истории болезни или в картотеке.

  Не допускается использование ID-карт с признаками высыхания геля, пузырьками в его толще или повреждением защитной фольги.

  Перед использованием образцы и реагенты должны быть выдержаны до комнатной температуры.

Заключение

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик.

Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для учебных целей в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод.

Гелевый тест выполняется и оценивается по выше приведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого атиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные результаты.

Источник : Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001

Общее количество белка крови 60-80 г/л. Различают несколько белковых фракций, выполняющих специфические функции.

1. Альбумины (40-60 г/л) обладают высокой коллоидно-осмотической активностью.

2. Глобулины a, b, g (20-40 г/л) создают гуморальный иммунитет, образуя различные антитела, называемые иммуноглобулинами (IgM, IgG).

3. Фибриноген (2-4 г/л) - главный фактор механизма свертывания крови.

АНТИГЕНЫ (греч. ànti - против, genos - создавать) - вещества, обладающие способностью вызывать в организме образование антител и вступать с ними в реакцию. В мембрану эритроцитов встроен целый ряд специфических полисахаридов - аминокислотных комплексов, обладающих антигенными свойствами. Эти комплексы называются агглютиногенами.

К настоящему времени в эритроцитах человека обнаружено более 400 антигенов, локализованных в мембране эритроцитов, 140 из которых объединены в 20 генетически контролируемых систем. Остальные антигены являются общими или индивидуальными. Для клинической практики наиболее важны система АВО и резус-система (Rh-система). Выделяют также группы Келл-Челано, Кидд, Лютеран, Даффи, Диего и др. Последние имеют значение лишь при частых переливаниях крови или при беременности, несовместимой по какому-то из этих агглютиногенов. Поэтому переливать повторно кровь от одного и того же донора не рекомендуется.

Антигены эритроцитов появляются на втором месяце эмбрионального развития, однако к моменту рождения ребенка агглютинабельная их активность низка и составляет 1/5 активности взрослых.

АНТИТЕЛА - вещества, вступающие в реакцию с антигеном. Естественные антитела всегда присутствуют в плазме крови и принадлежат к фракции гамма-глобулинов. К ним относятся антитела системы АВО - a и b агглютинины, которые появляются у человека в первые месяцы после рождения и достигают максимального количества к 5-10 годам жизни.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ - склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под действием специфических аннтител - агглютининов. Полагают, что молекула антитела двумя центрами связывания образует мостик между двумя эритроцитами. Каждый из этих эритроцитов в свою очередь связывается с другими эритроцитами и в результате происходит их склеивание. При переливании несовместимой крови агглютинация приводит к гемолизу эритроцитов и освобождению факторов свертывания крови. Образующиеся сгустки закупоривают мелкие сосуды и тем самым нарушают капиллярное кровообращение.

Агглютинация возникает при встрече одноименных агглютиногенов донора и агглютининов реципиента.

Антигены эритроцитов. На поверхности эритроцитов имеется более 100 антигенов, относящихся к 14 системам. Наиболее важными являются изогемагглютиногены системы АВО групп крови. По наличию А и В АГ и соответствующих им естественных антител (a- альфа, b- бетта) различают 4 группы у человека: 0 (I) – нет антигенов, есть a и b -антитела, А (II) – присутствуют только А антиген и b-антитела, В (III) – есть В антигены и a-антитела, АВ (IV) - есть оба антигена, нет антител.

Людям, имеющим антитела против антигенов А и В, нельзя переливать кровь тех, эритроциты которых несут соответствующие антигены. Так, реципиентам I группы крови (антитела альфа и бета) нельзя переливать эритроциты любой из остальных групп, так как наступит агглютинация и лизис этих эритроцитов.

У 85% людей на эритроцитах есть резус-АГ (Rh+), обнаруженный впервые у обезьян вида макака-резус. Такой антиген отсутствует у 15% людей. При наличии у резус-отрицательной женщины плода, на эритроцитах которого есть этот антиген (за счет генов отца), происходит иммунизация матери, и ее антитела могут разрушать эритроциты плода, особенно при повторной беременности.

Антигены лейкоцитов. На лейкоцитах (лимфоцитах) крови выявлена целая система лейкоцитарных АГ, она получила название HLA (Human Leycocyte Antigens), которая контролируется генами (главным комплексом гистосовместимости). HLA-антигены обусловливают несовместимость тканей при пересадках между индивидуумами. Наборы HLA-антигенов у каждого человека индивидуальны и только у однояйцовых близнецов они одинаковы. HLA участвует в распознавании антигенов и определяют предрасположенность к заболеваниям.

Гены, контролирующие синтез этих антигенов, локализованы в 6 хромосоме. Они занимают обширный генетический район и делятся на 5 классов. Важнейшее значение в иммунорегуляции имеют гены I и II классов гистосовместимости. Локусы генов I класса локализуются в периферическом плече хромосомы, II класса – ближе к центромере.

Молекулы HLA I класса являются гетеродимерами, так как состоят их двух различных цепей. Одна из них – тяжелая, с молекулярной массой 43 kDa, вторая – легкая, с молекулярной массой 11 kDa, нековалентно связанная с первой. Она представляет собой b2-микроглобулин. Тяжелая цепь имеет три домена (a1, a2, a3), выступающих на поверхности клетки, гидрофобный участок, фиксирующий цепь на мембране, и концевой участок в цитоплазме. HLA –АГ I класса имеется на всех ядросодержащих клетках: лимфоцитах, в меньшей степени – на клетках печени, легких, почек, очень редко на клетках мозга и скелетных мышц. Гены, контролирующие антигены I класса, представлены тремя локусами: HLA-A, HLA-B, HLA-C. В каждом локусе существует несколько аллелей, ответственных за синтез соответствующего антигена (эпитопа) и обозначаемых цифрами. Аллели локуса HLA-A кодируют синтез 21 антигенов, HLA-B - 25, HLA-C – 11 антигенов. С развитием иммуногенетики количество вновь открываемых аллелей постоянно увеличивается. Антигены I класса занимают примерно 1% клеточной поверхности. Они регулируют и ограничивают взаимодействие между Т-киллерами и клетками-мишенями. Отсюда их основная биологическая роль заключается в том, что АГ I класса являются маркерами «своего». Клетки, несущие эти АГ, не атакуются собственными Т-киллерами в связи с тем, что в эмбриогенезе аутореактивные Т-киллеры, распознающие антигены I класса на собственных структурах, уничтожаются или супрессируются.

Молекулы II класса системы HLA состоят из двух полипептидных цепей: a (молекулярная масса 34 kDa) и b (молекулярная масса 28 kDa). Обе цепи имеют по два домена (a1, a2 и b1, b2), закрепленные в клеточной мембране дополнительным участком. HLA-АГ II класса экспрессированы на В-лимфоцитах, макрофагах, активированных клетках после стимуляции их g-интерфероном. Гены, контролирующие антигены II класса, представлены тремя локусами: HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP. В локусе DR имеется 12 аллелей, в локусе DQ – 9, в локусе DP – 6 аллелей. HLA-АГ II класса участвуют в распознавании чужеродных антигенов, в межклеточных взаимодействиях В-лимфоцитов и макрофагов с Т-хелперами.

Антигены системы HLA наследуются по кодоминантному типу, т.е. экспрессируются оба антигена двух хромосом. У индивидуума может быть до 12 аллелей (по 2 из каждого локуса). Набор аллелей на хромосоме (гаплотип) наследуется целиком и существует только 4 возможных комбинации 2-х отцовских и 2-х материнских гаплотипов.

Определение HLA-антигенов необходимо в следующих ситуациях:

при типировании тканей с целью подбора донора реципиенту. Наибольшее значение имеет совместимость по антигенам локуса HLA-DR;

для установления связи экспрессии определенных антигенов и предрасположенности к тому или иному заболеванию. Наиболее сильная корреляция выявлена между наличием HLA-B27 и болезнью Бехтерева (анкилозирующий спондилоартрит): 95% больных имеют этот антиген.

при оценке иммунного статуса, когда используется выявление активированных Т-клеток, несущих HLA-DR антигены, и определение HLA-DR экспрессирующих мононуклеаров, участвующих в распознавании антигенов.

Аллоиммунные антитела – антитела к антигенам эритроцитов. Основные показания к применению: профилактика резус-конфликта при беременности, невынашивание беременности, гемолитическая болезнь новорожденных, переливание крови с целью профилактики посттрансфузионных осложнений.

В эритроцитах человека содержится большое количество групповые антигенов, образующих групповые системы, состоящие из одной или нескольких пар антигенов. Известны такие групповые системы крови, как - АВ0, резус-фактор, Келл, Левис (Lewis), Кидд, MNSs, Даффи, Диего и другие.
Аллоиммунные антиэритроцитарные антитела - антитела к резус-фактору и другим эритроцитарным антигенам, появляющиеся в крови после переливания несовместимой донорской крови или при беременности. Появление в сыворотке крови аллоиммунных антител свидетельствует о сенсибилизации организма и увеличения риска осложнений при переливании несовместимой крови, наличии риска невынашивания беременности и развитии гемолитической болезни плода у резус-отрицательной женщины при резус–положительной крови у плода.
Резус - антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, поскольку появляются в крови резус - отрицательных людей лишь при особых условиях. Условиями, способствующими образованию резус - антител, являются введение резус - отрицательному человеку резус - положительной крови или беременность резус - отрицательной женщины резус - положительным плодом. Аллоантитела содержатся в сыворотке индивида и не взаимодействуют с антигенами собственных эритроцитов. Они взаимодействуют с антигенами эритроцитов других пациентов после переливания крови или при беременности.
Определение резус - антител наряду с определением резус - принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус - несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью. Определение резус - антител требуется также при подготовке материла в целях использования для приготовления сывороток антирезус. Резус - антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные. Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус - антигены. Полные антитела, соединяясь с резус - антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется. Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус - антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин) или проведение пробы Кумбса. При всех перечисленных условиях реакция между резус - антителами и эритроцитами, содержащими резус - антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Антигены системы резус имеют белковое происхождение. Одной из характерных черт данной системы является выраженный полиморфизм, что обусловливает наличие многих разновидностей антигенов. В эритроцитах человека выявляется большое количество антигенов и их систем - D, Du, C, c, E, e, Cw, M, N, S, Kell, Kidd, Duffy, Diego и другие. Наибольшее клиническое значение в настоящее время имеют антигены из группы резусов Rh (5 основных) – D, C, c, E, e, а также антигены системы Kell (антигены – К, к, Кu и др.). Антиген D и представляет собой, так называемый, резус-фактор (Rh) . 86% населения Российской Федерации относят к резус-положительным (Rh+). Остальные 14 % населения являются резус-отрицательными (Rh-). Резус-отрицательными считают доноров, кровь которых не содержит ни одного из антигенов – D, C и E. Антиген D имеет разновидности, так называемые, «слабые» варианты, которые составляют группу – Du и встречающиеся с частотой 1%. Доноры, содержащие Du, должны быть отнесены к резус-положительным. Это необходимо учитывать при переливании крови для избежания гемотрансфузионных осложнений.

Обнаружить такие антигены можно, применяя специальные методы.
В основе теста лежит иммунологическая особенность эритроцитов группы 0 - они не несут на себе ни А-, ни В-антигенов. Поэтому любая агглютинация при добавлении к ним сыворотки пациента будет обусловлена присутствием в ней нетипичных антител. Отсутствие агглютинации указывает на их отсутствие.
В ряде случаев к данным антигенам в организме человека начинается выработка антител (аллоиммунных антител). Такое состояние чаще наблюдается при беременности и переливании крови. Во время беременности у резус-отрицательной матери резус-положительного плода может развиться резус-конфликт, заключающийся в образовании антител в организме матери к эритроцитам плода, что способствует разрушению эритроцитов плода. Такой конфликт может приводить к выкидышу или гемолитической анемии плода. Если плод резус-отрицательный у резус-положительной матери, то резус-конфликт не развивается. Наибольший риск возможен при беременности если мать принадлежит к первой группе крови и резус-отрицательна, а отец - первой группы и резус-положительный. В этом случае имеется один шанс из четырех, что ребенок будет резус-положительным.
Любой из выше перечисленных антигенов при попадании в кровь антиген-отрицательной матери (не содержащей различные виды эритроцитарных антигенов) может вызвать появление аутоантител и осложнять течение беременности. Иммуногенность основных антигенов системы-резус убывает в порядке: с- Е-С-е.

Для профилактики резус-конфликта при беременности резус-отрицательные женщины должны находиться на учете в женских консультациях и проходить периодические обследования на появление аллоиммунных антител (чаще определяют антитела к резус-фактору), поскольку риск развития резус конфликта в этой ситуации может составлять до 15%.

Аллоиммунные антитела – антитела к антигенам эритроцитов. Основные показания к применению: профилактика резус-конфликта при беременности, невынашивание беременности, гемолитическая болезнь новорожденных, переливание крови с целью профилактики посттрансфузионных осложнений.

В эритроцитах человека содержится большое количество групповые антигенов, образующих групповые системы, состоящие из одной или нескольких пар антигенов. Известны такие групповые системы крови, как - АВ0, резус-фактор, Келл, Левис (Lewis), Кидд, MNSs, Даффи, Диего и другие.
Аллоиммунные антиэритроцитарные антитела - антитела к резус-фактору и другим эритроцитарным антигенам, появляющиеся в крови после переливания несовместимой донорской крови или при беременности. Появление в сыворотке крови аллоиммунных антител свидетельствует о сенсибилизации организма и увеличения риска осложнений при переливании несовместимой крови, наличии риска невынашивания беременности и развитии гемолитической болезни плода у резус-отрицательной женщины при резус–положительной крови у плода.
Резус - антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, поскольку появляются в крови резус - отрицательных людей лишь при особых условиях. Условиями, способствующими образованию резус - антител, являются введение резус - отрицательному человеку резус - положительной крови или беременность резус - отрицательной женщины резус - положительным плодом. Аллоантитела содержатся в сыворотке индивида и не взаимодействуют с антигенами собственных эритроцитов. Они взаимодействуют с антигенами эритроцитов других пациентов после переливания крови или при беременности.
Определение резус - антител наряду с определением резус - принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус - несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью. Определение резус - антител требуется также при подготовке материла в целях использования для приготовления сывороток антирезус. Резус - антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные. Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус - антигены. Полные антитела, соединяясь с резус - антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется. Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус - антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин) или проведение пробы Кумбса. При всех перечисленных условиях реакция между резус - антителами и эритроцитами, содержащими резус - антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Антигены системы резус имеют белковое происхождение. Одной из характерных черт данной системы является выраженный полиморфизм, что обусловливает наличие многих разновидностей антигенов. В эритроцитах человека выявляется большое количество антигенов и их систем - D, Du, C, c, E, e, Cw, M, N, S, Kell, Kidd, Duffy, Diego и другие. Наибольшее клиническое значение в настоящее время имеют антигены из группы резусов Rh (5 основных) – D, C, c, E, e, а также антигены системы Kell (антигены – К, к, Кu и др.). Антиген D и представляет собой, так называемый, резус-фактор (Rh) . 86% населения Российской Федерации относят к резус-положительным (Rh+). Остальные 14 % населения являются резус-отрицательными (Rh-). Резус-отрицательными считают доноров, кровь которых не содержит ни одного из антигенов – D, C и E. Антиген D имеет разновидности, так называемые, «слабые» варианты, которые составляют группу – Du и встречающиеся с частотой 1%. Доноры, содержащие Du, должны быть отнесены к резус-положительным. Это необходимо учитывать при переливании крови для избежания гемотрансфузионных осложнений.

Обнаружить такие антигены можно, применяя специальные методы.
В основе теста лежит иммунологическая особенность эритроцитов группы 0 - они не несут на себе ни А-, ни В-антигенов. Поэтому любая агглютинация при добавлении к ним сыворотки пациента будет обусловлена присутствием в ней нетипичных антител. Отсутствие агглютинации указывает на их отсутствие.
В ряде случаев к данным антигенам в организме человека начинается выработка антител (аллоиммунных антител). Такое состояние чаще наблюдается при беременности и переливании крови. Во время беременности у резус-отрицательной матери резус-положительного плода может развиться резус-конфликт, заключающийся в образовании антител в организме матери к эритроцитам плода, что способствует разрушению эритроцитов плода. Такой конфликт может приводить к выкидышу или гемолитической анемии плода. Если плод резус-отрицательный у резус-положительной матери, то резус-конфликт не развивается. Наибольший риск возможен при беременности если мать принадлежит к первой группе крови и резус-отрицательна, а отец - первой группы и резус-положительный. В этом случае имеется один шанс из четырех, что ребенок будет резус-положительным.
Любой из выше перечисленных антигенов при попадании в кровь антиген-отрицательной матери (не содержащей различные виды эритроцитарных антигенов) может вызвать появление аутоантител и осложнять течение беременности. Иммуногенность основных антигенов системы-резус убывает в порядке: с- Е-С-е.

Для профилактики резус-конфликта при беременности резус-отрицательные женщины должны находиться на учете в женских консультациях и проходить периодические обследования на появление аллоиммунных антител (чаще определяют антитела к резус-фактору), поскольку риск развития резус конфликта в этой ситуации может составлять до 15%.