La diagnosi eziologica delle malattie virali viene effettuata con metodi genetici virologici, virologici, sierologici e molecolari. Gli ultimi tre metodi possono essere utilizzati come metodi diagnostici rapidi.

Metodo diagnostico virologico.

L'obiettivo finale del metodo è identificare i virus in una specie o variante sierologica. Il metodo virologico comprende diverse fasi:

1) selezione del materiale per la ricerca;

2) elaborazione di materiale contenente virus;

3) contaminazione di sistemi viventi sensibili con materiale;

4) indicazione di virus nei sistemi viventi;

5) titolazione dei virus isolati;

6) identificazione di virus nelle reazioni immunitarie.

1. Selezione del materiale per la ricerca .

Viene eseguito nelle prime fasi della malattia, fatte salve le regole che impediscono la contaminazione del materiale con microflora estranea e l'infezione del personale medico. Per prevenire l'inattivazione del virus durante il trasporto, il materiale viene posto in un mezzo di trasporto virale (VTS) costituito da soluzione salina bilanciata, antibiotici e albumina sierica. Il materiale viene trasportato in un apposito contenitore con isolamento termico e buste di plastica chiuse contenenti ghiaccio. Se necessario, il materiale viene conservato a -20˚C. Ogni campione di materiale per la ricerca dovrebbe essere etichettato ed etichettato con il nome del paziente, il tipo di materiale, la data del prelievo, la diagnosi clinica dettagliata e altre informazioni.

A seconda della natura della malattia, il materiale per lo studio può essere:

1) tamponi dalla parte nasale della faringe e un tampone dalla faringe;

2) liquido cerebrospinale;

3) feci e tamponi rettali;

6) fluido da cavità sierose;

7) striscio dalla congiuntiva;

8) contenuto di vescicole;

8) materiale sezionale.

Per ottenere il lavaggio dall'orofaringe si utilizzano 15-20 ml di VTS. Il paziente risciacqua accuratamente la gola del VTS per 1 minuto e raccoglie il filo in una fiala sterile.

Una macchia dalla parte posteriore della faringe viene prelevata con un batuffolo di cotone sterile, premendo sulla radice della lingua con una spatola. Il tampone viene posto in 2-3 ml di VTS, sciacquato e strizzato.

Il liquido cerebrospinale si ottiene mediante puntura lombare. 1-2 ml di liquido cerebrospinale vengono posti in un contenitore sterile e consegnati al laboratorio.

I campioni fecali vengono prelevati entro 2-3 giorni in fiale sterili. Una sospensione al 10% viene preparata dal materiale ottenuto utilizzando la soluzione di Hank. La sospensione viene centrifugata a 3000 rpm, il supernatante viene raccolto, addizionato di antibiotici e posto in un contenitore sterile.

Il sangue ottenuto dalla venipuntura in un volume di 5-10 ml viene defibrinato aggiungendo eparina. Il sangue intero non viene congelato e non vengono aggiunti antibiotici. Per ottenere il siero, i campioni di sangue vengono incubati a 37°C per 60 minuti.

Il fluido dalle cavità sierose si ottiene mediante puntura nella quantità di 1-2 ml. Il liquido viene utilizzato immediatamente o mantenuto congelato.

Uno striscio dalla congiuntiva viene prelevato con un tampone sterile e posto nel VTS, dopodiché il materiale viene centrifugato e congelato.

Il contenuto delle vescicole viene aspirato con una siringa con ago sottile e posto nel VTS. Il materiale viene inviato al laboratorio sotto forma di strisci essiccati su vetrino o in capillari o fiale sterili sigillati.

Il materiale sezionale viene prelevato il prima possibile, osservando le regole dell'asepsi. Per raccogliere ciascun campione vengono utilizzati set separati di strumenti sterili. La quantità di tessuti selezionati è di 1-3 g, che vengono posti in fiale sterili. Innanzitutto vengono prelevati campioni di organi extracavitari (cervello, linfonodi, ecc.). I tessuti della cavità toracica vengono prelevati prima di aprire la cavità addominale. I campioni di tessuto risultanti vengono macinati in un mortaio con l'aggiunta di sabbia sterile e soluzione sterile di cloruro di sodio, dopodiché il materiale viene centrifugato. Il supernatante viene raccolto in fiale, vengono aggiunti antibiotici. Il materiale per la ricerca virologica viene utilizzato immediatamente o conservato a -20°C.

2. Elaborazione di materiale contenente virus.

Viene eseguito per liberare il materiale dalla microflora batterica che lo accompagna. Per questo vengono utilizzati metodi fisici e chimici.

Metodi fisici:

1) filtrazione attraverso vari filtri batterici;

2) centrifugazione.

Metodi chimici:

1) trattamento del materiale con etere nei casi di isolamento di virus privi di supercapside;

2) aggiunta al materiale di una miscela di eptano e freon;

3) l'introduzione di antibiotici (penicillina - 200-300 U / ml; streptomicina - 200-500 μg / ml; nistatina - 100-1000 U / ml).

3. Infezione di sistemi viventi sensibili con materiale.

1) animali da laboratorio;

2) embrioni di pollo;

3) colture di organi;

4) coltura tissutale.

animali da laboratorio. Vengono utilizzati topi bianchi, porcellini d'India, criceti, conigli, ecc.. I topi bianchi sono i più sensibili a un gran numero di tipi di virus. La modalità di infezione degli animali è determinata dal tropismo del virus nei tessuti. L'infezione nel cervello viene utilizzata nell'isolamento dei virus neurotropici (virus della rabbia, poliovirus, ecc.). L'infezione intranasale viene eseguita quando vengono isolati i patogeni delle infezioni respiratorie. Metodi di infezione ampiamente utilizzati per via intramuscolare, endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea e di altro tipo. Gli animali malati vengono soppressi con l'etere, aperti e il materiale viene prelevato da organi e tessuti.

embrioni di pollo. Ampiamente disponibile e facile da usare. Applicare embrioni di pollo di età compresa tra 5 e 14 giorni. Prima dell'infezione, gli embrioni di pollo vengono ovoscopati: viene determinata la loro vitalità, il bordo del sacco aereo e la posizione dell'embrione (l '"occhio oscuro" dell'embrione) sono segnati sul guscio. Il lavoro con embrioni di pollo viene effettuato in una scatola sterile con strumenti sterili (pinzette, siringhe, forbici, lance, ecc.). Dopo aver completato un frammento dell'opera, gli strumenti vengono immersi in alcool etilico al 70% e bruciati prima della successiva manipolazione. Prima dell'infezione, il guscio di un embrione di pollo viene pulito con un tampone imbevuto di alcol e una soluzione alcolica di iodio. Il volume del materiale di prova iniettato nell'embrione è di 0,1-0,2 ml. Almeno 4 embrioni di pulcino vengono utilizzati per isolare i virus da un materiale.

metodi per studiare la biologia dei virus e la loro identificazione. In virologia sono ampiamente utilizzati metodi di biologia molecolare, con l'aiuto dei quali è stato possibile stabilire la struttura molecolare delle particelle virali, come penetrano nella cellula e le caratteristiche della riproduzione dei virus, la struttura primaria degli acidi nucleici virali e proteine. Sono in fase di sviluppo metodi per determinare la sequenza degli elementi costitutivi degli acidi nucleici virali e degli amminoacidi proteici. Diventa possibile collegare le funzioni degli acidi nucleici e delle proteine ​​da essi codificate con la sequenza nucleotidica e stabilire le cause dei processi intracellulari che giocano un ruolo importante nella patogenesi di un'infezione virale.

I metodi di ricerca virologica si basano anche su processi immunologici (interazione di un antigene con anticorpi), proprietà biologiche del virus (capacità di emoagglutinare, emolisi, attività enzimatica), caratteristiche dell'interazione del virus con la cellula ospite (la natura dell'effetto citopatico, formazione di inclusioni intracellulari, ecc.).

Nella diagnosi delle infezioni virali, nella coltivazione, nell'isolamento e nell'identificazione dei virus, nonché nella preparazione dei preparati vaccinali, è ampiamente utilizzato il metodo della coltura di tessuti e cellule. Vengono utilizzate colture cellulari primarie, secondarie, continue stabili e diploidi. Le colture primarie si ottengono disperdendo il tessuto con enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi). La fonte delle cellule può essere tessuti e organi (più spesso reni) di embrioni umani e animali. Una sospensione di cellule in un mezzo nutritivo viene posta nei cosiddetti materassi, bottiglie o capsule di Petri, dove, dopo essersi attaccate alla superficie del vaso, le cellule iniziano a moltiplicarsi. Per l'infezione da virus, di solito viene utilizzato un monostrato cellulare. Il liquido nutritivo viene drenato, la sospensione virale viene introdotta in determinate diluizioni e, dopo il contatto con le cellule, viene aggiunto mezzo nutritivo fresco, solitamente senza siero.

Le cellule della maggior parte delle colture primarie possono essere sottocoltivate e sono indicate come colture secondarie. Con l'ulteriore passaggio delle cellule, si forma una popolazione di cellule simili ai fibroblasti, in grado di riprodursi rapidamente, la maggior parte delle quali conserva il set originale di cromosomi. Queste sono le cosiddette cellule diploidi. Nella coltivazione in serie di cellule si ottengono colture cellulari continue stabili. Durante i passaggi compaiono cellule omogenee in rapida divisione con un insieme eteroploide di cromosomi. Le linee cellulari stabili possono essere monostrato e sospensione. Le colture monostrato crescono sotto forma di uno strato continuo sulla superficie del vetro, le colture in sospensione crescono sotto forma di sospensioni in vari recipienti mediante agitatori. Esistono oltre 400 linee cellulari derivate da 40 diverse specie animali (inclusi primati, uccelli, rettili, anfibi, pesci, insetti) e umani.

Pezzi di singoli organi e tessuti (colture di organi) possono essere coltivati ​​in mezzi nutritivi artificiali. Questi tipi di colture preservano la struttura dei tessuti, che è particolarmente importante per l'isolamento e il passaggio di virus che non si riproducono in colture di tessuti indifferenziati (ad esempio, coronavirus).

Nelle colture cellulari infette, i virus possono essere rilevati da un cambiamento nella morfologia cellulare, dall'azione citopatica, che può essere specifica, dalla comparsa di inclusioni, determinando gli antigeni virali nella cellula e nel fluido di coltura; determinazione delle proprietà biologiche della progenie virale nel fluido di coltura e titolazione dei virus nella coltura di tessuti, embrioni di pollo o animali sensibili; rilevando singoli acidi nucleici virali nelle cellule mediante ibridazione molecolare o gruppi di acidi nucleici mediante metodo citochimico mediante microscopia a fluorescenza.

L'isolamento dei virus è un processo lungo e laborioso. Viene effettuato per determinare il tipo o la variante del virus circolante tra la popolazione (ad esempio, per identificare la sierovariante del virus dell'influenza, il ceppo selvaggio o vaccinale del virus della poliomielite, ecc.); nei casi in cui è necessario eseguire misure epidemiologiche urgenti; quando compaiono nuovi tipi o varianti di virus; se necessario, confermare la diagnosi preliminare; per l'indicazione di virus in oggetti ambientali. Quando si isolano i virus, viene presa in considerazione la possibilità della loro persistenza nel corpo umano, nonché il verificarsi di un'infezione mista causata da due o più virus. Una popolazione geneticamente omogenea di un virus ottenuta da un singolo virione è chiamata clone virale e il processo per ottenerlo è chiamato clonazione.

Per isolare i virus, viene utilizzata l'infezione di animali da laboratorio suscettibili, embrioni di pollo, ma viene spesso utilizzata la coltura tissutale. La presenza di un virus è generalmente determinata dalla degenerazione cellulare specifica (effetto citopatico), dalla formazione di simplasti e sincizi, dal rilevamento di inclusioni intracellulari, nonché da un antigene specifico rilevato mediante immunofluorescenza, emoassorbimento, emoagglutinazione (nei virus emoagglutinanti), ecc. . Questi segni possono essere rilevati solo dopo 2-3 passaggi del virus.

Per l'isolamento di una serie di virus, come i virus dell'influenza, vengono utilizzati embrioni di pollo, per l'isolamento di alcuni virus Coxsackie e una serie di arbovirus vengono utilizzati topi appena nati. L'identificazione dei virus isolati viene effettuata utilizzando test sierologici e altri metodi.

Quando si lavora con i virus, viene determinato il loro titolo. La titolazione dei virus viene solitamente eseguita nella coltura tissutale, determinando la massima diluizione del fluido contenente il virus, in corrispondenza della quale si verifica la degenerazione dei tessuti, si formano inclusioni e antigeni specifici del virus. Il metodo della placca può essere utilizzato per titolare un certo numero di virus. Le placche, o colonie negative di virus, sono focolai di cellule distrutte dal virus di una coltura tissutale a strato singolo sotto rivestimento di agar. Il conteggio delle colonie consente un'analisi quantitativa dell'attività infettiva dei virus sulla base del fatto che una particella virale infettiva forma una placca. Le placche vengono identificate colorando la coltura con coloranti vitali, solitamente rosso neutro; le placche non assorbono il colorante e quindi sono visibili come punti luminosi sullo sfondo delle cellule viventi colorate. Il titolo del virus è espresso come numero di unità formanti placca in 1 ml.

La purificazione e la concentrazione dei virus viene solitamente effettuata mediante ultracentrifugazione differenziale seguita da centrifugazione in gradienti di concentrazione o densità. Per purificare i virus vengono utilizzati metodi immunologici, cromatografia a scambio ionico, immunosorbenti, ecc.

La diagnosi di laboratorio delle infezioni virali include il rilevamento dell'agente patogeno o dei suoi componenti nel materiale clinico; isolamento del virus da questo materiale; sierodiagnosi. La scelta del metodo diagnostico di laboratorio in ogni singolo caso dipende dalla natura della malattia, dal periodo della malattia e dalle capacità del laboratorio. La moderna diagnostica delle infezioni virali si basa su metodiche espresse che consentono di ottenere una risposta poche ore dopo l'assunzione del materiale clinico nelle prime fasi dopo la malattia, tra cui la microscopia elettronica e immunitaria elettronica, nonché l'immunofluorescenza, il metodo di ibridazione molecolare, la rilevamento di anticorpi della classe lgM, ecc.

La microscopia elettronica di virus colorati negativamente consente la differenziazione dei virus e la determinazione della loro concentrazione. L'uso della microscopia elettronica nella diagnosi delle infezioni virali è limitato a quei casi in cui la concentrazione di particelle virali nel materiale clinico è sufficientemente elevata (10 5 in 1 ml e superiori). Lo svantaggio del metodo è l'incapacità di distinguere tra virus appartenenti allo stesso gruppo tassonomico. Questo svantaggio viene eliminato utilizzando la microscopia elettronica immunitaria. Il metodo si basa sulla formazione di immunocomplessi quando si aggiunge siero specifico alle particelle virali, mentre si verifica la concentrazione simultanea di particelle virali, che consente di identificarle. Il metodo è utilizzato anche per rilevare gli anticorpi. Ai fini della diagnostica espressa, viene eseguito un esame al microscopio elettronico di estratti di tessuto, feci, liquido delle vescicole e segreti del rinofaringe. La microscopia elettronica è ampiamente utilizzata per studiare la morfogenesi del virus; le sue capacità sono ampliate con l'uso di anticorpi marcati.

Il metodo di ibridazione molecolare, basato sulla rilevazione di acidi nucleici specifici del virus, consente di rilevare singole copie di geni e non ha eguali in termini di sensibilità. La reazione si basa sull'ibridazione di filamenti complementari di DNA o RNA (sonde) e sulla formazione di strutture a doppio filamento. La sonda più economica è il DNA ricombinante clonato. La sonda è marcata con precursori radioattivi (solitamente fosforo radioattivo). L'uso di reazioni colorimetriche è promettente. Esistono diverse varianti di ibridazione molecolare: ibridazione puntuale, ibridazione blot, ibridazione sandwich, ibridazione in situ, ecc.

Gli anticorpi della classe lgM compaiono prima degli anticorpi di classe G (il 3-5° giorno di malattia) e scompaiono dopo alcune settimane, quindi il loro rilevamento indica un'infezione recente. Gli anticorpi della classe IgM vengono rilevati mediante immunofluorescenza o immunodosaggio enzimatico utilizzando antisieri anti-μ (sieri a catena pesante anti-IgM).

I metodi sierologici in virologia si basano su reazioni immunologiche classiche (vedi Metodi immunologici di ricerca) : reazioni di fissazione del complemento, inibizione dell'emoagglutinazione, neutralizzazione biologica, immunodiffusione, emoagglutinazione indiretta, emolisi radiale, immunofluorescenza, saggio immunoenzimatico, saggio radioimmunologico. Sono stati sviluppati micrometodi per molte reazioni e le loro tecniche vengono continuamente migliorate. Questi metodi vengono utilizzati per identificare i virus utilizzando un set di sieri noti e per la sierodiagnosi al fine di determinare l'aumento degli anticorpi nel secondo siero rispetto al primo (il primo siero viene prelevato nei primi giorni dopo la malattia, il secondo - dopo 2-3 settimane). Il valore diagnostico non è inferiore a un aumento quadruplo degli anticorpi nel secondo siero. Se il rilevamento di anticorpi della classe lgM indica un'infezione recente, gli anticorpi della classe lgC persistono per diversi anni e talvolta per tutta la vita.

Per identificare i singoli antigeni di virus e anticorpi contro di essi in miscele complesse senza previa purificazione proteica, viene utilizzato l'immunoblotting. Il metodo combina il frazionamento delle proteine ​​utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide con il successivo dosaggio immunologico delle proteine ​​mediante dosaggio immunoenzimatico. La separazione delle proteine ​​riduce i requisiti per la purezza chimica dell'antigene e rende possibile l'identificazione di singole coppie antigene-anticorpo. Questo compito è rilevante, ad esempio, nella sierodiagnosi dell'infezione da HIV, dove le reazioni di immunodosaggio enzimatico falso positivo sono dovute alla presenza di anticorpi contro antigeni cellulari, che sono presenti a causa di un'insufficiente purificazione delle proteine ​​​​virali. L'identificazione di anticorpi nei sieri dei pazienti contro antigeni virali interni ed esterni consente di determinare lo stadio della malattia e, nell'analisi delle popolazioni, la variabilità delle proteine ​​​​virali. L'immunoblotting nell'infezione da HIV viene utilizzato come test di conferma per rilevare singoli antigeni virali e anticorpi contro di essi. Quando si analizzano le popolazioni, il metodo viene utilizzato per determinare la variabilità delle proteine ​​virali. Il grande valore del metodo risiede nella possibilità di analizzare gli antigeni sintetizzati utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante, stabilendone la dimensione e la presenza di determinanti antigenici.

20) Il principale componente strutturale dei virioni (particelle virali complete) è un nucleocapside, cioè la guaina proteica (capside) che racchiude il genoma virale (DNA o RNA). Il nucleocapside della maggior parte delle famiglie di virus è circondato da un involucro lipoproteico. Tra l'involucro e il nucleocapside in alcuni virus (orto-, paramixo-, rhabdo-, filo- e retrovirus) è presente una proteina della matrice non glicosilata, che conferisce ulteriore rigidità ai virioni. I virus della maggior parte delle famiglie hanno un involucro che svolge un ruolo importante nell'infettività. I virioni acquisiscono lo strato esterno dell'involucro quando il nucleocapside penetra nella membrana cellulare gemmando. Le proteine ​​dell'involucro sono codificate dal virus e i lipidi sono presi in prestito dalla membrana cellulare. Le glicoproteine ​​solitamente sotto forma di dimeri e trimeri formano peplomeri (sporgenze) sulla superficie dei virioni (orto-, paramixovirus, rhabdo-, filo-, corona-, bunya-, arena-, retrovirus). Le proteine ​​di fusione glicosilate sono associate ai peplomeri e svolgono un ruolo chiave nell'ingresso del virus nella cellula. I capsidi e gli involucri dei virioni sono formati da molte copie di uno o più tipi di subunità proteiche come risultato di un processo di autoassemblaggio. L'interazione nel sistema proteina-proteina, a causa di deboli legami chimici, porta all'unificazione dei capsidi simmetrici. Le differenze nei virus nella forma e nelle dimensioni dei virioni dipendono dalla forma, dalle dimensioni e dal numero delle subunità proteiche strutturali e dalla natura dell'interazione tra di esse. Il capside è costituito da molte subunità morfologicamente espresse (capsomeri) assemblate da polipeptidi virali in un modo rigorosamente definito, secondo principi geometrici relativamente semplici. Le subunità proteiche, che si connettono tra loro, formano capsidi di due tipi di simmetria: isometrica ed elicoidale. La struttura del nucleocapside dei virus con involucro è simile alla struttura del nucleocapside dei virus senza involucro. Sulla superficie dell'involucro dei virus si distinguono le strutture glicoproteiche morfologicamente espresse - i peplomeri. La composizione della membrana del supercapside comprende lipidi (fino al 20-35%) e carboidrati (fino al 7-8%), che sono di origine cellulare. Consiste in un doppio strato di lipidi cellulari e proteine ​​​​specifiche del virus situate all'esterno e all'interno del biostrato lipidico. Lo strato esterno del guscio del supercapside è rappresentato da peplomeri (sporgenze) di uno o più tipi, costituiti da una o più molecole di glicoproteine. Il nucleocapside dei virus avvolti è spesso chiamato nucleo e la parte centrale dei virioni contenenti l'acido nucleico è chiamata nucleoide. I capsomeri (peplomeri) sono costituiti da unità strutturali costituite da una o più catene polipeptidiche omologhe o eterologhe (subunità proteiche). classificazione dei virus I capsidi isometrici non sono sfere, ma poliedri regolari (icosaedri). Le loro dimensioni lineari sono identiche lungo gli assi di simmetria. Secondo Kaspar e Klug (1962), i capsomeri nei capsidi sono disposti secondo la simmetria icosaedrica. Tali capsidi sono costituiti da subunità identiche che formano un icosaedro. Hanno 12 vertici (angoli), 30 facce e 20 superfici sotto forma di triangoli isosceli. Secondo questa regola, il capside del poliovirus e del virus dell'afta epizootica è formato da 60 unità strutturali proteiche, ciascuna delle quali è costituita da quattro catene polipeptidiche. L'icosaedro risolve in modo ottimale il problema dell'impacchettamento di subunità ripetute in una rigida struttura compatta con un volume minimo. Solo alcune configurazioni di subunità strutturali possono formare le superfici, i vertici e le facce dell'icosaedro virale. Ad esempio, le subunità strutturali dell'adenovirus formano capsomeri esagonali (esoni) su superfici e facce e capsomeri pentagonali (peptoni) in cima. In alcuni virus, entrambi i tipi di capsomeri sono formati dagli stessi polipeptidi, in altri da polipeptidi diversi. Poiché le subunità strutturali di diversi virus differiscono l'una dall'altra, alcuni virus sembrano essere più esagonali, altri più sferici. Tutti i virus dei vertebrati contenenti DNA conosciuti, ad eccezione dei virus del vaiolo, così come molti virus contenenti RNA (7 famiglie) hanno un tipo di simmetria del capside cubico. I reovirus, a differenza di altri virus dei vertebrati, hanno un doppio capside (esterno e interno), ciascuno costituito da unità morfologiche. I virus con un tipo di simmetria elicoidale hanno la forma di una struttura filamentosa cilindrica, il loro RNA genomico ha la forma di una spirale e si trova all'interno del capside. Tutti i virus animali a simmetria elicoidale sono circondati da un involucro lipoproteico. I nucleocapsidi elicoidali sono caratterizzati da lunghezza, diametro, passo dell'elica e numero di capsomeri per giro dell'elica. Quindi, nel virus Sendai (paramyxovirus), il nucleocapside è un'elica lunga circa 1 μm, con un diametro di 20 nm e un passo dell'elica di 5 nm. Il capside è costituito da circa 2400 unità strutturali, ciascuna delle quali è una proteina con un peso molecolare di 60 kD. Ci sono 11-13 subunità per giro dell'elica. Nei virus con un tipo elicoidale di simmetria nucleocapsidica, il ripiegamento delle molecole proteiche in un'elica garantisce la massima interazione tra l'acido nucleico e le subunità proteiche. Nei virus icosaedrici, l'acido nucleico è avvolto all'interno dei virioni e interagisce con uno o più polipeptidi situati all'interno del capside.

Antirecettori (recettori) virali- proteine ​​del virione di superficie, ad esempio l'emoagglutinina, che si legano in modo complementare al corrispondente recettore di una cellula suscettibile.

21) Metodi immunologici nella ricerca virologica.

I test sierologici variano nella loro capacità di rilevare singole classi di anticorpi. Il test di agglutinazione, ad esempio, è efficace nel rilevare gli anticorpi IgM, ma è meno sensibile nel rilevare gli anticorpi IgG. I test di fissazione del complemento e di emolisi, che richiedono il complemento, non rilevano gli anticorpi che non si legano al complemento, come gli anticorpi IgA e gli anticorpi IgE. Solo gli anticorpi diretti contro i determinanti antigenici della superficie del virione associati alla patogenicità partecipano alla reazione di neutralizzazione del virus. Sensibilità I. m. e. supera tutti gli altri metodi per lo studio di antigeni e anticorpi, in particolare il radioimmunodosaggio e l'immunodosaggio enzimatico consentono di catturare la presenza di proteine ​​in quantità misurabili in nanogrammi e persino in picogrammi. Con l'aiuto di I. m. e. determinare il gruppo e verificare la sicurezza del sangue (epatite B e infezione da HIV). All'atto del trapianto di tessuti e corpi E. m. consentire la determinazione della compatibilità dei tessuti e il test dei metodi di soppressione dell'incompatibilità. In medicina legale, la reazione di Castellani viene utilizzata per determinare la specie specificità di una proteina e la reazione di agglutinazione per determinare il gruppo sanguigno.

I metodi immunologici sono ampiamente utilizzati nella diagnostica di laboratorio delle malattie infettive. L'eziologia della malattia viene stabilita anche sulla base dell'aumento degli anticorpi contro il patogeno nel siero del sangue del convalescente rispetto al campione prelevato nei primi giorni della malattia. Basato su I. m. e. studiare l'immunità della popolazione in relazione alle infezioni di massa, come l'influenza, e valutare anche l'efficacia delle vaccinazioni preventive.

A seconda del loro meccanismo e del resoconto dei risultati I. m. può essere suddiviso in reazioni basate sul fenomeno dell'agglutinazione; reazioni basate sul fenomeno delle precipitazioni; reazioni che coinvolgono il complemento; reazione di neutralizzazione; reazioni con metodi chimici e fisici.

Reazioni basate sul fenomeno dell'agglutinazione. L'agglutinazione è l'incollaggio di cellule o singole particelle - portatori di un antigene con l'aiuto del siero immunitario a questo antigene.

Il test di agglutinazione batterica che utilizza un siero antibatterico appropriato è uno dei test sierologici più semplici. Una sospensione di batteri viene aggiunta a varie diluizioni del siero del sangue testato e dopo un certo tempo di contatto a t ° 37 ° viene registrato a quale diluizione massima si verifica l'agglutinazione del siero del sangue. La reazione di agglutinazione dei batteri viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive: brucellosi, tularemia, febbre tifoide e febbre paratifoide, dissenteria bacillare e tifo.

La reazione di emoagglutinazione passiva o indiretta (RPGA, RNGA). Utilizza eritrociti o materiali sintetici neutri (ad esempio particelle di lattice), sulla cui superficie vengono adsorbiti antigeni (batterici, virali, tissutali) o anticorpi. La loro agglutinazione si verifica quando vengono aggiunti i sieri o gli antigeni appropriati.

La reazione di emoagglutinazione passiva è utilizzata per diagnosticare malattie causate da batteri (tifo e paratifo, dissenteria, brucellosi, peste, colera, ecc.), protozoi (malaria) e virus (influenza, infezioni da adenovirus, epatite virale B, morbillo, infezioni da zecche encefalite, febbre emorragica di Crimea, ecc.), nonché per determinare alcuni ormoni, per identificare l'ipersensibilità del paziente a farmaci e ormoni, come la penicillina e l'insulina.

Il test di inibizione dell'emoagglutinazione (HITA) si basa sul fenomeno di prevenzione (inibizione) del siero immunitario dell'emoagglutinazione degli eritrociti da parte dei virus e viene utilizzato per rilevare e titolare gli anticorpi antivirali. Serve come metodo principale di sierodiagnosi di influenza, morbillo, rosolia, parotite, encefalite da zecche e altre infezioni virali, i cui agenti causali hanno proprietà emoagglutinanti. ad esempio, per la sierodiagnosi dell'encefalite da zecche, nei pozzetti del pannello vengono versate diluizioni doppie del siero del paziente in una soluzione tampone di borato alcalino. Quindi si aggiunge una certa quantità, solitamente 8 AU (unità agglutinanti), di antigene dell'encefalite da zecche, e dopo 18 ore di esposizione a t°4° si aggiunge una sospensione di eritrociti d'oca preparata in una soluzione tampone fosfato acida. Se nel siero del sangue del paziente sono presenti anticorpi contro il virus dell'encefalite trasmessa da zecche, l'antigene viene neutralizzato e non si verifica l'agglutinazione eritrocitaria.

Reazioni basate sul fenomeno della precipitazione. La precipitazione si verifica a seguito dell'interazione di anticorpi con antigeni solubili. L'esempio più semplice di una reazione di precipitazione è la formazione di una banda di precipitazione opaca in una provetta al confine della stratificazione dell'antigene su un anticorpo. Sono ampiamente utilizzati vari tipi di reazioni di precipitazione in agar semiliquido o gel di agarosio (metodo della doppia immunodiffusione Ouchterlon, metodo dell'immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi), sia qualitativi che quantitativi. Come risultato della libera diffusione nel gel di antigeni e anticorpi nella zona del loro rapporto ottimale, si formano complessi specifici: bande di precipitazione, che vengono rilevate visivamente o mediante colorazione. Una caratteristica del metodo è che ogni coppia antigene-anticorpo forma una singola banda di precipitazione e la reazione non dipende dalla presenza di altri antigeni e anticorpi nel sistema in esame.

Le reazioni che coinvolgono il complemento, che viene utilizzato come siero di cavia fresco, si basano sulla capacità del sottocomponente del complemento Clq e quindi di altri componenti del complemento di attaccarsi agli immunocomplessi.

La reazione di fissazione del complemento (CFR) consente la titolazione di antigeni o anticorpi in base al grado di fissazione del complemento da parte del complesso antigene-anticorpo. Questa reazione consiste in due fasi: l'interazione dell'antigene con il siero del sangue di prova (sistema di test) e l'interazione del siero emolitico con gli eritrociti di ariete (sistema indicatore). Con una reazione positiva, la fissazione del complemento si verifica nel sistema in esame e quindi, quando si aggiungono eritrociti sensibilizzati con anticorpi, non si osserva emolisi. La reazione è utilizzata per la sierodiagnosi della sifilide (reazione di Wassermann), delle infezioni virali e batteriche.

La reazione di neutralizzazione si basa sulla capacità degli anticorpi di neutralizzare determinate funzioni specifiche di antigeni macromolecolari o solubili, come l'attività enzimatica, le tossine batteriche e la patogenicità dei virus. La reazione di neutralizzazione delle tossine può essere valutata dall'effetto biologico, ad esempio, i sieri antitetanici e antibotulinici sono titolati. Una miscela di tossina e antisiero somministrata agli animali non ne causa la morte. Varie varianti della reazione di neutralizzazione sono utilizzate in virologia. Quando i virus vengono miscelati con un antisiero appropriato e questa miscela viene somministrata ad animali o colture cellulari, la patogenicità dei virus viene neutralizzata e gli animali non si ammalano e le cellule delle colture non subiscono distruzione.

Reazioni mediante etichette chimiche e fisiche. L'immunofluorescenza consiste nell'utilizzo di anticorpi marcati con fluorocromo, più precisamente, la frazione immunoglobulinica degli anticorpi IgG. Un anticorpo marcato con un fluorocromo forma un complesso antigene-anticorpo con l'antigene, che diventa disponibile per l'osservazione al microscopio ai raggi UV che eccitano la luminescenza del fluorocromo. La reazione di immunofluorescenza diretta viene utilizzata per studiare gli antigeni cellulari, rilevare virus nelle cellule infette e rilevare batteri e rickettsia negli strisci.

Il metodo dell'immunofluorescenza indiretta è più ampiamente utilizzato. si basa sul rilevamento di un complesso antigene-anticorpo utilizzando un siero anticorpale anti-lgG luminescente e viene utilizzato per rilevare non solo gli antigeni, ma anche la titolazione degli anticorpi.

I metodi immunoenzimatici, o immunologici enzimatici, si basano sull'uso di anticorpi coniugati con enzimi, principalmente perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina. Come l'immunofluorescenza, il dosaggio immunoenzimatico viene utilizzato per rilevare gli antigeni nelle cellule o per titolare gli anticorpi sulle cellule contenenti antigeni.

Il metodo radioimmunologico si basa sull'uso di una marcatura radioisotopica di antigeni o anticorpi. È il metodo più sensibile per la determinazione di antigeni e anticorpi, utilizzato per determinare ormoni, farmaci e antibiotici, per la diagnosi di malattie batteriche, virali, rickettsie, protozoiche, lo studio delle proteine ​​​​del sangue, gli antigeni tissutali.

L'immunoblotting viene utilizzato per rilevare anticorpi contro singoli antigeni o "riconoscere" antigeni da sieri noti. Il metodo consiste in 3 fasi: separazione di macromolecole biologiche (ad esempio un virus) in singole proteine ​​mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide; trasferire le proteine ​​separate dal gel su un supporto solido (blot) applicando una lastra di gel di poliacrilammide su carta attivata o nitrocellulosa (electroblotting); rilevazione delle proteine ​​desiderate sul substrato mediante dosaggio immunoenzimatico diretto o indiretto. Come metodo diagnostico, l'immunoblotting viene utilizzato per l'infezione da HIV. Il valore diagnostico è il rilevamento di anticorpi contro una delle proteine ​​​​del guscio esterno del virus.

22) Tipi di virus a simmetria (cubici, elicoidali, misti). Interazione di proteine ​​e acidi nucleici nella confezione dei genomi virali.

A seconda dell'interazione del capside con l'acido nucleico, le particelle virali possono essere suddivise in diversi tipi di simmetria:

1). Tipo di simmetria cubica.

I capsidi cubici sono icosideri con circa 20 superfici triangolari e 12 vertici. Formano una struttura che ricorda una formazione sferica, ma in realtà è un poliedro. In alcuni casi, speciali formazioni lipoproteiche chiamate punte sono attaccate ai vertici di tali poliedri icosaedrici. Il ruolo di questi picchi è presumibilmente ridotto all'interazione di virioni o particelle virali con le corrispondenti aree di cellule ospiti ad essi sensibili. Con la simmetria cubica, l'acido nucleico virale è imballato strettamente (arrotolato in una palla) e le molecole proteiche lo circondano, formando un poliedro (icosaedro). Un icosaedro è un poliedro con venti facce triangolari che ha simmetria cubica e una forma approssimativamente sferica. I virus icosaedrici includono virus herpes simplex, reovirus, ecc.

2). Tipo di simmetria a spirale. I capsidi a spirale sono in qualche modo più semplici. Quelli. I capsomeri che compongono il capside coprono l'elica NK e formano anche un guscio proteico abbastanza stabile di questi virus. E quando si usano microscopi elettronici ad alta risoluzione e metodi di preparazione appropriati, si possono vedere strutture a spirale sui virus. Con la simmetria elicoidale del capside, l'acido nucleico virale forma una figura elicoidale (o elicoidale), vuota all'interno, e anche le subunità proteiche (capsomeri) sono impilate attorno ad esso a spirale (capside tubolare). Un esempio di virus con una simmetria elicoidale del capside è il virus del mosaico del tabacco, che è a forma di bastoncino, e la sua lunghezza è di 300 nm con un diametro di 15 nm. La composizione di una particella virale include una molecola di RNA di circa 6000 nucleotidi. Il capside è costituito da 2000 subunità proteiche identiche disposte a spirale.

3). Simmetria di tipo misto o complesso. Di norma, questo tipo di simmetria si trova principalmente tra i virus batterici. E gli esempi classici sono quei fagi, E. coli o fagi temperati. Si tratta di formazioni complesse che hanno una testa con contenuto nucleico interno, vari tipi di appendici, un processo di coda e un dispositivo di vari gradi di complessità. E ogni componente di tali particelle è dotato di una funzione specifica che si realizza nel processo di interazione tra il virus e la cellula. In altre parole, un tipo complesso di simmetria è una combinazione di simmetria cubica, la testa è un poliedro icosiderico e le formazioni a forma di bastoncino sono i processi della coda. Sebbene tra i virus batterici ci siano anche virioni organizzati in modo abbastanza semplice, che sono nucleocapsidi primitivi, di forma sferica o cubica. I virus batterici sono più complessi dei virus delle piante e degli animali.

24) Interazione di un fago con una cellula. Fagi virulenti e temperati.

Adsorbimento.

L'interazione inizia con l'attaccamento di particelle virali alla superficie cellulare. Il processo diventa possibile in presenza di opportuni recettori sulla superficie della cellula e di anti-recettori sulla superficie della particella virale.

I virus utilizzano recettori cellulari progettati per trasportare sostanze essenziali: particelle nutritive, ormoni, fattori di crescita, ecc.

Recettori: proteine, componente glucidica di proteine ​​e lipidi, lipidi. Recettori specifici determinano l'ulteriore destino della particella virale (trasporto, consegna ad aree del citoplasma o del nucleo). Il virus può attaccarsi a recettori non specifici e persino penetrare nella cellula. Tuttavia, questo processo non causa infezione.

Inizialmente, si forma un singolo legame tra l'antirecettore e il recettore. Questo legame è fragile e può rompersi. Per la formazione dell'adsorbimento irreversibile è necessario l'attaccamento multivalente. Il legame stabile si verifica a causa del libero movimento delle molecole del recettore nella membrana. Durante l'interazione del virus con la cellula si osserva un aumento della fluidità dei lipidi e la formazione di campi recettoriali nell'area di interazione tra il virus e la cellula. I recettori di un certo numero di virus possono essere presenti solo in un insieme limitato di cellule ospiti. Ciò determina la sensibilità dell'organismo a questo virus. Pertanto, il DNA e l'RNA virali hanno la capacità di infettare una gamma più ampia di cellule ospiti.

Gli antirecettori possono essere trovati in organelli virali unici: strutture di crescita nei batteriofagi T, fibre negli adenovirus, punte sulla superficie delle membrane virali, corona nei coronavirus.

Penetrazione.

2 meccanismi: endocitosi del recettore e fusione della membrana.

Endocitosi del recettore:

Il solito meccanismo per l'ingresso di nutrienti e sostanze regolatrici nella cellula. Si verifica in aree specializzate - dove ci sono fosse speciali ricoperte di clatrina, recettori specifici si trovano sul fondo della fossa. Le fosse forniscono una rapida invaginazione e la formazione di vacuoli ricoperti di clatrina (non passano più di 10 minuti dal momento dell'adsorbimento, in un minuto possono formarsi fino a 2000 vacuoli). I vacuoli si fondono con vacuoli citoplasmatici più grandi per formare recettoriosomi (che non contengono più clatrina), che a loro volta si fondono con i lisosomi.

Fusione delle membrane virali e cellulari:

Nei virus con involucro, la fusione è mediata da interazioni puntuali della proteina virale con i lipidi della membrana cellulare, con conseguente integrazione dell'involucro della lipoproteina virale con la membrana cellulare. Nei virus senza involucro, una delle proteine ​​di superficie interagisce anche con i lipidi della membrana cellulare e la componente interna passa attraverso la membrana (nei paramixovirus, la proteina F; negli ortomixovirus, la subunità emoagglutinante HA2). La conformazione delle proteine ​​di superficie è influenzata dal pH.

Striscia.

In questo processo, l'attività infettiva scompare, appare spesso la sensibilità alle nucleasi e sorge la resistenza agli anticorpi. Il prodotto finale della svestizione sono gli acidi nucleici legati a una proteina virale interna. La fase di svestizione limita anche la possibilità di infezione (i virus non sono in grado di spogliarsi in ogni cellula). La svestizione avviene in aree specializzate della cellula: lisosomi, apparato di Golgi e spazio perinucleare.

La svestizione avviene a seguito di una serie di reazioni. Ad esempio, nei picornavirus, la svestizione procede con la formazione di particelle subvirali intermedie con dimensioni da 156 a 12S. Negli adenovirus nel citoplasma e nei pori nucleari e ha almeno 3 stadi:

Formazione di particelle subvirali con una densità maggiore rispetto ai virioni;

Formazione di nuclei in cui mancano 3 proteine ​​virali;

Formazione di un complesso DNA-proteina in cui il DNA è legato covalentemente a una proteina terminale.

Caratterizzazione di fagi virulenti e temperati.

Quando un batterio viene infettato da un fago, si verifica una cosiddetta infezione litica, cioè un'infezione che culmina nella lisi della cellula ospite, ma questa è caratteristica solo dei cosiddetti fagi virulenti, la cui interazione con la cellula porta alla morte cellulare e alla formazione di una progenie fagica.

In questo caso si distinguono le seguenti fasi in base alle interazioni del fago con la cellula: miscelazione del fago con la coltura cellulare (la molteplicità di infezione è di 1 fago per 10 cellule), e la concentrazione deve essere sufficientemente elevata in modo che il i fagi possono contattare le cellule. Per evitare la reinfezione - dopo l'infezione per un massimo di 5 minuti, quando i fagi vengono adsorbiti - questa miscela di cellule con fago viene diluita. C'è un periodo di latenza durante il quale il numero di fagi non aumenta, quindi un periodo di uscita molto breve, quando il numero di particelle fagiche aumenta bruscamente, quando la cellula si lisa e la progenie fagica viene rilasciata, e quindi il numero di fagi rimane al stesso livello, perché la reinfezione non si verifica. Sulla base di questa curva si possono distinguere queste fasi: il periodo vegetativo di "crescita" (periodo di latenza), il periodo di uscita e calcolare la resa fagica per 1 cellula infetta. Durante il periodo di latenza, nei batteri non si trova nulla che assomigli a particelle fagiche e non è possibile isolare il principio infettivo da tali cellule nel periodo di latenza. Solo le particelle fagiche mature possono infettare i batteri. Pertanto, i fagi virulenti causano sempre la morte dei batteri e producono infezione, che si rivela nella produzione di nuove particelle virali in grado di infettare le cellule successive e altre cellule sensibili.

Contrariamente a quelli virulenti, l'infezione da fagi temperati non porta alla lisi delle cellule batteriche, ma si realizza la formazione di uno stato speciale di coesistenza di un fago con una cellula batterica. Questa coesistenza si esprime nel fatto che un certo inizio del fago è presente nella cellula batterica senza condizioni sfavorevoli per essa e si conserva di generazione in generazione. In certi stadi di tale coesistenza, il fago viene attivato nella cellula ed entra nello stato del ciclo litico di sviluppo, provocando la lisi cellulare e il rilascio della progenie fagica. Tali fagi sono chiamati fagi lisogenici o temperati, e lo stato di esistenza moderata con il fago è la lisogenia, ei batteri che contengono un fago così latente sono chiamati batteri lisogenici. Il termine batteri lisogenici deriva dal fatto che una volta furono scoperte colture in cui appariva spontaneamente un fago, e questo batteriofago iniziò a essere considerato come contaminazione della coltura, cioè un virus batterico entra nella coltura, e tali colture furono chiamate lisogeniche, cioè generano lisi .

numero di classe 2 7

SOGGETTO: INTERAZIONE DEI VIRUS CON CELLULE SENSIBILI. COLTIVAZIONE. METODI DI INDICAZIONEe identificazione.IMMUNITÀ ANTIVIRALE.

LISTA DI CONTROLLO

1. Virus, natura e origine. Storia della scoperta. Fasi di sviluppo della virologia. Il concetto di virione, la sua struttura. Composizione chimica e proprietà dei virus.

2. Principi di classificazione dei virus - criteri. Famiglie di virus contenenti RNA e DNA (controllo).

3. Tropismo dei virus. Interazione di virus con cellule sensibili - fasi.

4. Coltivazione di virus. Indicazione e identificazione dei virus durante la loro coltivazione su colture cellulari ed embrioni di pollo. Colture cellulari, linee cellulari, produzione, condizioni di coltivazione.

5. Classificazione delle infezioni virali: a) a livello cellulare; b) a livello dell'organismo.

6. Metodi per la diagnosi di laboratorio delle infezioni virali. Metodi diretti per lo studio di materiale clinico (rilevazione di virus, antigeni virali o NK virali). Metodo diagnostico virologico. Sierodiagnosi delle infezioni virali.

7. Immunità antivirale - fattori. resistenza delle specie. Fattori di protezione antivirale aspecifici (inibitori, interferone, complemento, fagocitosi). Immunità acquisita (meccanismi umorali e cellulari).

8. Principi di prevenzione specifica e terapia delle infezioni virali: vaccini, sieri immuni (immunoglobuline), interferoni, chemioterapia etiotropica.

LAVORO DI LABORATORIO

DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI

1. Per la diagnostica rapida utilizzare:

UN) determinazione dell'antigene virale nel materiale di prova utilizzando sieri antivirali diagnostici nelle reazioni: RIF, ELISA, RIA, contro immunoelettroforesi (VIEF), reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA), reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA), ecc .;

V) rilevamento dei virioni in materiale patologico mediante microscopia elettronica o IEM.

d) rilevamento di genomi virali metodi di genetica molecolare: PCR; ibridazione molecolare di acidi nucleici mediante sonde marcate.

2. Metodo virologico

Fasi principali:

1. Campionamento del materiale di prova.

2. Selezione secondo il principio del citotropismo e ottenimento di un sistema di test sensibile, determinandone la vitalità.

3. Infezione del sistema selezionato.

4. Indicazione del virus basata sul rilevamento del suo acido nucleico, antigeni, emoagglutinina, CPE, inclusioni.

5. L'identificazione e la titolazione del virus vengono effettuate sulla base di:

a) determinazione degli antigeni virali mediante reazioni immunologiche (RIF, ELISA, RPHA, RSK, RN, VIEF, ecc.); b) esame istopatologico di organi e tessuti; c) sviluppo professionale continuo; d) sintomi clinici, campioni biologici (cheratocongiuntivale, ecc.).

Metodo virologico (schema)

Materiale indagato (feci, tamponi nasofaringei, materiale sezionale, ecc.)

Trattamento antibiotico per sopprimere batteri e funghi

microflora, centrifugazione, filtrazione

Infezione serie

embrioni di pollo