Reticolociti (significato clinico e diagnostica di laboratorio). Metodi di colorazione dei reticolociti Conta dei reticolociti utilizzando il metodo Gel Meyer

Gli antipiretici per i bambini sono prescritti da un pediatra. Ma ci sono situazioni di emergenza con la febbre in cui il bambino ha bisogno di ricevere immediatamente medicine. Quindi i genitori si assumono la responsabilità e usano farmaci antipiretici. Cosa è consentito dare ai neonati? Come abbassare la temperatura nei bambini più grandi? Quali farmaci sono i più sicuri?

I reticolociti sono globuli rossi giovani che si formano dopo che i normoblasti perdono i loro nuclei. Una caratteristica dei reticolociti è la presenza nel loro citoplasma di una sostanza granulare-filamentosa (reticolo), che rappresenta ribosomi e mitocondri aggregati.

1.) Contare il numero di reticolociti in uno striscio dopo averli colorati con coloranti speciali.

Questo metodo è in pratica il metodo più utilizzato perché è semplice, abbastanza economico e non richiede attrezzature speciali costose e di conseguenza può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio diagnostico clinico.

Il principio del metodo si basa sull'identificazione della sostanza granulare-reticolare dei reticolociti durante la colorazione sopravitale con vernici alcaline (soluzione satura di blu cresilico brillante in alcool assoluto / soluzione Azur I / soluzione Azur II) con ulteriore conteggio in uno striscio di sangue. La colorazione dei reticolociti viene eseguita su vetro o in una provetta. Il conteggio viene effettuato utilizzando un microscopio: gli strisci preparati utilizzando uno dei metodi sopra indicati vengono esaminati al microscopio con una lente ad immersione; nello striscio, reticolociti ed eritrociti sono di colore giallo-verdastro, la sostanza granulare-filamentosa nei reticolociti è blu (se colorata con azzurro II e blu cresilo brillante) o viola-bluastra (se colorata con azzurro I).

2.) Conteggio del numero di reticolociti mediante microscopia a fluorescenza.

Questo metodo è semplice e richiede poco tempo, è più accurato del metodo convenzionale, poiché la microscopia a fluorescenza rivela i grani più piccoli di una sostanza filamentosa a rete, ma è possibile solo con un microscopio a fluorescenza e coloranti speciali, ed è quindi disponibile solo ad alcuni laboratori.

Il principio del conteggio del numero di reticolociti mediante microscopia a fluorescenza si basa sulla capacità della sostanza reticolocitaria di fluorescere dopo aver trattato il sangue con arancio di acridina. Il sangue viene miscelato con l'arancia di acridina in una provetta o in un mixer in un rapporto di 1 parte di sangue e 10 parti di vernice (la miscela può essere conservata per non più di 5 ore). La miscela viene agitata per 2 minuti, una goccia della miscela viene applicata su un vetrino e coperta con un coprioggetto. In questo caso il liquido non deve oltrepassare il coprioggetto.

Microscopia utilizzando un filtro luminoso ZhS-17. Nella preparazione, i globuli rossi hanno contorni verde scuro e non emettono fluorescenza, e nei reticolociti la sostanza a maglia granulare si illumina di rosso brillante, rendendo i reticolociti facili da contare. Nel sangue stabilizzato con eparina o citrato di sodio non si osserva fluorescenza dei reticolociti.

3.) Conta automatica dei reticolociti utilizzando un analizzatore ematologico.

Nei moderni analizzatori ematologici, la tecnologia per il conteggio delle cellule del sangue si basa sul metodo conduttometrico proposto da H. Wallace e Joseph R. Culter nel 1947. Il principio del metodo è contare il numero e determinare la natura degli impulsi che si verificano quando un la cella passa attraverso un foro (apertura) di piccolo diametro, su entrambi i lati del quale sono presenti due elettrodi isolati l'uno dall'altro. Ogni passaggio di una cellula attraverso l'apertura è accompagnato dalla comparsa di un impulso elettrico, che viene registrato da un sensore elettronico. La divisione delle cellule in categorie (eritrociti, leucociti, piastrine, sedimento) viene effettuata dall'apparecchio sulla base dell'analisi dell'ampiezza degli impulsi ricevuti.Per determinare la concentrazione delle cellule è sufficiente far passare un certo volume di campione attraverso il canale e contare il numero di impulsi generati.

Va notato che oltre al parametro classico dei reticolociti - il contenuto relativo (%) di reticolociti (RET%, percentuale di reticolociti), determinato utilizzando i metodi 1 e 2 della diagnostica di laboratorio, in connessione con l'avvento dell'alta tecnologia analizzatori ematologici (metodo 3) è diventato possibile ottenere (ad esempio, utilizzando un colorante fluorescente brevettato per l'analizzatore Sysmex-XT-2000i) parametri informativi aggiuntivi sui reticolociti:
reticolociti a basso contenuto di RNA, i più maturi (LFR%, frazioni reticolocitarie a bassa fluorescenza);
reticolociti con contenuto medio di RNA (MFR%, frazioni reticolocitarie a fluorescenza media) - frazione di reticolociti con fluorescenza media);
reticolociti ad alto contenuto di RNA (HFR%, frazioni di reticolociti ad alta fluorescenza) - una frazione di reticolociti ad alta fluorescenza);
frazione di reticolociti immaturi (IRF%, frazione di reticolociti immaturi).

La differenziazione dei reticolociti, in base al grado di maturità e, di conseguenza, al contenuto di acidi nucleici, è un riflesso dell'attività ematopoietica del midollo osseo.

Metodologia (analizzatore Sysmex -XT- 2000i). In una cella a flusso, le cellule attraversano un raggio laser a semiconduttore, provocando la diffusione del raggio ad alto e basso angolo e l'eccitazione di un colorante fluorescente. Ciò consente di determinare i diversi stadi di maturità dei reticolociti in base al contenuto di RNA nelle cellule e all'intensità della loro luminescenza. Il conteggio automatizzato dei reticolociti è estremamente accurato (vengono contati più di 30.000 globuli rossi) e riproducibile (il coefficiente di variazione è di circa il 6%). Questa tecnologia garantisce un conteggio accurato dei reticolociti anche a concentrazioni estremamente basse.

I reticolociti sono un indicatore del numero di cellule, precursori dei globuli rossi, formate nel midollo osseo. Reticolociti: i globuli rossi giovani riflettono la capacità rigenerativa del midollo osseo. La conta dei reticolociti viene utilizzata per valutare l'intensità dell'ematopoiesi. Lo studio viene effettuato quando: diminuzione del numero di globuli rossi, sospetta emolisi, valutazione dell'eritropoiesi, nel trattamento dell'anemia con integratori di ferro e vitamina B 12, eritropoietina.

I reticolociti sono globuli rossi anucleati, immaturi, la cui maturazione avviene entro 24-48 ore dal rilascio nel sangue periferico dal midollo osseo. Il numero di reticolociti formati riflette l'attività eritropoietica del midollo osseo. In altre parole, il contenuto di reticolociti riflette il tasso di formazione dei globuli rossi e funge da indicatore della risposta del midollo osseo all’anemia.

Oltre ai parametri generalmente accettati dei reticolociti - contenuto assoluto e relativo (%) dei reticolociti, l'emergere di nuovi analizzatori ematologici (colorazione con coloranti speciali per acidi nucleici) ha permesso di ottenere ulteriori parametri dei reticolociti:

Reticolociti a basso contenuto di RNA, i più maturi (LFR%, frazione di reticolociti a bassa fluorescenza);
reticolociti con contenuto medio di RNA (MFR%, frazione di reticolociti con fluorescenza media);
reticolociti ad alto contenuto di RNA (HFR%, frazione di reticolociti ad alta fluorescenza);
frazione di reticolociti immaturi (IRF%, frazione di reticolociti immaturi).

La differenziazione dei reticolociti, in base al grado di maturità e, di conseguenza, al contenuto di acidi nucleici, è un riflesso dell'attività ematopoietica del midollo osseo.

Contare i reticolociti in uno striscio dopo averli colorati con coloranti speciali

Principio del metodo: rilevamento della sostanza granulare-reticolare dei reticolociti durante la colorazione sopravitale con vernici alcaline con ulteriore conteggio in uno striscio di sangue.

Puoi utilizzare uno dei seguenti coloranti: Soluzione Azur I; Soluzione Azur II;

Procedura di determinazione: La colorazione viene effettuata su vetro o in una provetta.

Colorazione dei reticolociti in una provetta con Azure II

In una provetta vengono posti 0,05 ml di soluzione colorante azzurro II e 0,2 ml di sangue. La miscela viene accuratamente miscelata e lasciata per 20-30 minuti. Mescolare nuovamente e preparare degli strisci sottili.

Colorazione dei reticolociti in una provetta con Azure I

Mettere 0,3–0,5 ml di soluzione colorante azur I e 5–6 gocce di sangue in una provetta utilizzando una pipetta dell'apparato Panchenkov. La provetta viene chiusa con un tappo di gomma, la miscela viene miscelata accuratamente ma accuratamente e lasciata per 1 - 1,5 ore (i reticolociti si colorano meglio con un'esposizione di 1,5 - 3 ore). Mescolare e preparare strisci sottili.

Gli strisci preparati vengono esaminati al microscopio con una lente ad immersione. Nello striscio, i reticolociti e gli eritrociti sono di colore giallo-verdastro, la sostanza granulare-filamentosa nei reticolociti è blu (se colorata con azzurro II) o viola-bluastra (se colorata con azzurro I).

I reticolociti sono un importante indicatore della capacità rigenerativa del midollo osseo. Un loro aumento nel sangue periferico (reticolocitosi) si osserva nell'anemia emolitica, nelle crisi emolitiche, nella perdita di sangue acuta, nella malaria, nel trattamento dell'anemia sideropenica con ferro, nella carenza acuta di ossigeno. La presenza di un numero maggiore di reticolociti consente di sospettare un'emorragia nascosta (ad esempio, in pazienti con febbre tifoide, ulcera peptica).

Una diminuzione del numero o dell'assenza di reticolociti (reticolocitopenia) si osserva nell'anemia aplastica e ipoplastica rigenerativa; anemia causata da insufficienza di ferro, vitamina B12, acido folico; con metastasi tumorali alle ossa; malattia da radiazioni; radioterapia; trattamento con citostatici.

Tecnica per eseguire il test di Rivalta.

Il test Rivalta è un test biochimico per differenziare il trasudato e l'essudato.

La tecnica è la seguente: gli essudati contengono sieromucina (un composto di natura globulinica), che dà un test positivo (denaturazione) con una soluzione debole di acido acetico. Nel cilindro si versano 100-150 ml di acqua distillata, si acidifica con 2-3 gocce di acido acetico glaciale e si aggiunge goccia a goccia il liquido in esame. Una goccia di essudato che cade forma una nuvola a forma di nuvola bianca che scende sul fondo della nave. Una goccia di trasudato non forma torbidità, oppure è insignificante e si dissolve rapidamente. Nonostante queste differenze tra essudati e trasudati, nella pratica non è sempre facile distinguerli, poiché a volte si ha a che fare con una serie di fluidi di transizione, nonché con essudati, che sono vicini ai trasudati nel contenuto proteico e nella densità relativa.

Principio. Colorazione sopravitale con coloranti che rivelano la sostanza granulare-reticolare dei reticolociti.

Reagenti. Si può utilizzare uno dei seguenti coloranti: 1) una soluzione satura di blu cresilico brillante in alcool etilico assoluto. Per preparare l'alcol assoluto, è necessario immergere l'etanolo al 96% in diversi cambi di polvere di solfato di rame calcinato. Per 100 ml di alcool assoluto assumere 1,2 g di vernice; 2) soluzione di azzurro 1 secondo PN Korikov: azzurro I - 1 g; ossalato di ammonio - 0,4 g; cloruro di sodio - 0,8 g; Alcool etilico al 96% - 10 ml; acqua distillata - 90 ml. La soluzione di pittura in una bottiglia chiusa viene posta in un termostato a 37 °C per 2–3 giorni e agitata vigorosamente periodicamente. Quindi raffreddare a temperatura ambiente e filtrare su un filtro di carta. La soluzione è conservata in un contenitore di vetro scuro. Se compaiono sedimenti, la vernice deve essere nuovamente filtrata; 3) Soluzione Azur II: Azur II - 1 g; citrato di sodio - 5 g; cloruro di sodio - 0,4 g; acqua distillata - 45 ml. La soluzione viene lasciata in termostato a 37°C per 2 giorni, agitando di tanto in tanto. Per accelerare la dissoluzione, la vernice può essere riscaldata a fuoco basso per 15-20 minuti, senza portarla a ebollizione. Raffreddare a temperatura ambiente e filtrare. Conservare in contenitori di vetro scuro.

Progresso della determinazione. Dipinto su vetro. Un vetrino di vetro ben lavato e sgrassato viene riscaldato sulla fiamma di un bruciatore.

Usando una bacchetta di vetro, applica una goccia di uno dei coloranti sul vetro e prepara una macchia di vernice usando il vetro smerigliato. Segnare il lato del vetro su cui viene applicato il tratto di vernice con uno steklograf. In questa forma, il vetro può essere preparato per un uso futuro e conservato in un luogo asciutto e buio. Applicare una goccia di sangue su una macchia di vernice, preparare uno striscio sottile e posizionarlo immediatamente in una camera umida per 3-4 minuti (è possibile utilizzare una capsula Petri con rotoli di cotone idrofilo inumidito, garza o carta da filtro posizionati lungo i bordi). Quindi gli strisci vengono asciugati all'aria.

Negli strisci preparati in questo modo, i globuli rossi sono di colore giallastro-verdastro e la sostanza a rete granulare è blu.

Colorazione in vitro. Metodo 1: prima dell'uso, preparare in una provetta una soluzione di lavoro di blu cresilico brillante in ragione di 1 goccia di soluzione di ossalato di potassio all'1% e 4 gocce di soluzione di vernice (reagente 1). Aggiungere 0,04 ml di sangue alla vernice (due pipette fino alla tacca 0,02). La miscela viene miscelata accuratamente ma delicatamente e lasciata per 30 minuti. Mescolare e preparare strisci sottili.

Metodo 2: 0,05 ml di soluzione colorante 3 e 0,2 ml di sangue vengono posti in una provetta. La miscela viene accuratamente miscelata e lasciata per 20-30 minuti. Mescolare e preparare strisci sottili.

Metodo 3: aggiungere 0,3–0,5 ml della soluzione di pittura 2 e 5-6 gocce di sangue in una provetta utilizzando una pipetta dell'apparato Panchenkov. La provetta viene chiusa con un tappo di gomma, la miscela viene miscelata accuratamente ma con attenzione e lasciata per 1–1,5 ore (i reticolociti si colorano meglio con un'esposizione di 1,5–3 ore). Mescolare e preparare strisci sottili.

Conta dei reticolociti. Negli strisci, i globuli rossi sono di colore giallastro-verdastro, la sostanza a rete granulare è blu o viola-bluastra.

Gli strisci preparati utilizzando uno dei metodi sopra indicati vengono esaminati al microscopio utilizzando una lente ad immersione. È necessario contare almeno 1000 globuli rossi (una maggiore precisione si ottiene contando 2000-3000 globuli rossi) e annotare tra questi il numero di cellule contenenti sostanza granulare-reticolare. In pratica, per una maggiore precisione, viene utilizzato un oculare speciale, in cui il campo visivo può essere ridotto alla dimensione richiesta. Per strisci sottili e uniformi in cui i globuli rossi si trovano in una fila, selezionare un campo visivo in cui sono presenti, ad esempio, 50 globuli rossi, quindi calcolare 20 campi visivi di questo tipo.

Se non disponi di un oculare già pronto, puoi prepararlo facilmente svitando l'oculare 7×, inserendo un pezzo di carta con un quadratino ritagliato e avvitandolo. Il numero di reticolociti contati è espresso per 1000 o per 100 globuli rossi.

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Reticolociti (significato clinico e diagnostica di laboratorio)

(1) reticolociti che hanno un nucleo (eritronormoblasti) e la loro granularità si trova sotto forma di un bordo denso attorno al nucleo;

(2) reticolociti aventi una sostanza a maglia granulare sotto forma di una palla o di un grumo;

(3) reticolociti, granulari sotto forma di una fitta rete;

(4) reticolociti, aventi una sostanza a rete granulare sotto forma di singoli fili;

(5) reticolociti contenenti singoli granuli.

Con anemia emolitica (il numero di reticolociti può raggiungere il 60% o più (aumentando particolarmente fortemente durante le crisi emolitiche);

In caso di perdita di sangue acuta (una crisi reticolocitaria si verifica 3-5 giorni dopo la perdita di sangue), compreso un aumento dei reticolociti, si può sospettare un'emorragia nascosta (ad esempio, nei pazienti con ulcera peptica del tratto gastrointestinale, febbre tifoide);

Quando si tratta l'anemia da carenza di ferro con ferro (diversi giorni (3 - 10) dopo l'inizio del trattamento antianemico dell'anemia perniciosa);

In caso di grave mancanza di ossigeno;

Con metastasi tumorali al midollo osseo.

Forma anomala di emoglobina;

Per l'anemia aplastica e ipoplastica rigenerativa;

Per l'anemia causata da insufficienza di ferro, vitamina B12, acido folico (anemia microcitica-ipocromica e megaloblastica);

Con anemia sideroblastica;

Con metastasi tumorali alle ossa;

Per la malattia da radiazioni e la radioterapia;

Quando trattato con citostatici;

Per le malattie autoimmuni del sistema emopoietico;

Per le malattie renali;

Con recidiva di anemia di Addison-Biermer;

Scelta errata dell'anticoagulante o miscelazione insufficiente del sangue con l'anticoagulante;

Spremitura prolungata della mano con un laccio emostatico;

Assunzione di sulfamidici (sono possibili sia risultati sottostimati che sovrastimati);

Trasfusione di sangue poco prima dello studio;

Emolisi di un campione di sangue.

Valutazione dell'attività dell'eritropoiesi in condizioni accompagnate da emolisi o perdita di sangue;

Valutare la capacità del midollo osseo di rigenerarsi dopo terapia citotossica e trapianto di midollo osseo;

Valutazione del ripristino della sintesi dell'eritropoietina dopo trapianto di rene;

Controllo antidoping per gli atleti (che assumono eritropoietina);

Rilevazione della ridotta capacità rigenerativa del midollo osseo dovuta a carenza di ferro, vitamine B12, B6, acido folico, rame e monitoraggio della terapia appropriata;

Valutazione della risposta alla terapia con eritropoietina ed eritrosoppressori.

Reticolociti a basso contenuto di RNA, i più maturi (LFR%, frazioni reticolocitarie a bassa fluorescenza);

Reticolociti con contenuto medio di RNA (MFR%, frazioni reticolocitarie a fluorescenza media) - frazione di reticolociti con fluorescenza media);

Reticolociti ad alto contenuto di RNA (HFR%, frazioni di reticolociti ad alta fluorescenza) - una frazione di reticolociti ad alta fluorescenza);

Reticolociti: cosa sono, norme per bambini e adulti, alto e basso, ruolo nel corpo

In un esame del sangue generale, è spesso possibile trovare designazioni di cellule come RET - reticolociti. Non sono cellule nel vero senso della parola, poiché non hanno un nucleo, proprio come i globuli rossi maturi. Nel frattempo, la determinazione di queste forme non è inclusa nell'elenco degli indicatori obbligatori della ricerca ematologica. Se il medico ne ha bisogno, sottolinea separatamente i parametri che gli interessano. Naturalmente, le persone che hanno dovuto sottoporsi a tale analisi vogliono sapere che tipo di cellule sono i reticolociti e perché vengono trattate in modo così ambiguo.

Chi sono e quanti sono?

I reticolociti sono globuli rossi “appena prodotti” che hanno appena lasciato il midollo osseo.

Il tasso di reticolociti nel sangue periferico di un adulto supera appena l'1% (secondo vari autori da 0,8 - 1,3 a 0,2 - 2%). Nei bambini appena nati, la norma può essere del 10%, ma man mano che il bambino cresce e si sviluppa, gli indicatori iniziano a diminuire e entro due settimane di vita si avvicinano il più possibile ai valori normali degli adulti.

In generale, l'eritropoiesi dei neonati è un argomento a parte: un test effettuato 12 ore dopo la nascita mostra un notevole aumento del livello di emoglobina (fino a 200 g/l), di globuli rossi (fino a 6,0 h/l e oltre) e di reticolociti. Questo quadro ematico viene osservato per diversi giorni, quindi questi indicatori iniziano a diminuire, il che è associato a una diminuzione della produzione di eritropoietina. Dopo due settimane o un mese, la produzione di eritropoietina aumenta nuovamente, il che porta ad un aumento del livello dei reticolociti e alla normalizzazione dell'eritropoiesi (in un bambino di sei mesi le norme non sono più molto diverse da quelle degli adulti). A questo proposito, vorrei attirare l'attenzione del lettore sulla designazione delle unità per misurare il numero di reticolociti; il loro contenuto può essere espresso in ppm, quindi i numeri aumenteranno di 10 volte.

Tabella: norme dei reticolociti per età

Tuttavia, l’età “fino a un anno” comprende diversi periodi molto importanti per il corpo del bambino. Inoltre, sarebbe utile tenere conto dell'opinione di vari autori che stanno prendendo in considerazione altre opzioni, in cui le norme per i bambini sono scritte letteralmente per giorno e mese e, quindi, differiscono leggermente dai valori precedenti. C'è una notevole differenza nelle norme degli adulti.

Spetta al paziente scegliere a quale tabella credere, anche se se ne possono trovare molte altre in diverse fonti; tuttavia, nei casi dubbi, non sarebbe male chiedere al laboratorio con quale metodo è stato effettuato il calcolo (microscopia o analizzatore automatico) e quali valori di riferimento utilizza il laboratorio.

Perché sono così pochi e qual è il loro ruolo?

L'antenato dei globuli rossi della serie eritroide è una cellula che non contiene emoglobina, ma possiede comunque un nucleo, come si conviene a una cellula vera e propria, l'eritroblasto, che in condizioni normali si trasforma in un eritroblasto basofilo (pronormoblasto, dove compaiono i primi segni di emoglobinizzazione sono già visibili (stadio policromatofilo).

Se tutto è in ordine con l'ematopoiesi e le condizioni corrispondono a quelle fisiologiche, allora il futuro eritrocita attraversa gli stadi di pronormoblasto e normoblasto (rappresenta lo stadio finale dello sviluppo degli eritrociti, quando ha ancora un nucleo). Con l'ulteriore maturazione della cellula, si verifica l'involuzione del nucleo e il successivo predecessore, un normocita policromatofilo, lo perde ancora, trasformandosi in un giovane normocita chiamato reticolocita. I reticolociti non hanno più un nucleo, ma contengono emoglobina e hanno la capacità di trasportare ossigeno e anidride carbonica.

I reticolociti rientrano tra gli indicatori di un esame del sangue generale, ma vengono ricercati solo nei casi in cui sia necessario studiare intensità dell'eritropoiesi. Il conteggio del numero dei globuli rossi viene effettuato su 1000 globuli rossi e mira a determinare la velocità di produzione dei globuli rossi da parte del midollo osseo: con la produzione accelerata il numero dei reticolociti aumenta, con l'inibizione diminuisce . L'eritropoiesi bruscamente accelerata può portare al fatto che non solo i reticolociti, ma anche i loro precursori - i normoblasti - escono dal midollo osseo in quantità maggiori del necessario. Tuttavia, perché non possono essere contate come le altre cellule durante un esame del sangue clinico?

Richiedono una verniciatura separata

Dopo la perdita del nucleo, i globuli rossi percepiscono solo coloranti acidi e la microscopia ottica non rivela in essi alcuna struttura intracellulare che consenta di classificare gli elementi formati come specie giovani o mature. Tuttavia, i reticolociti possono essere trovati utilizzando metodi di colorazione speciali. La colorazione sopravitale con blu brillante di cresile o arancio di acridina, che rivela una sostanza basofila - formazioni granulari o filiformi, aiuta a isolare le forme giovani - i reticolociti - dalla massa totale (1000 cellule) di globuli rossi in uno striscio.

Intanto, avendo nel citoplasma una sostanza a rete caratteristica dei reticolociti, che determina il nome delle cellule (substantia reticulofilamentosa), non tutte sono “uguali dalla faccia”, quindi sono divise in 5 gruppi, ciascuno dei quali ha le proprie caratteristiche della posizione della sostanza basofila (BS):

Reticolociti nucleari, che prendono il nome dalla posizione della BV sotto forma di corolla o nucleo.
Cellule a forma di groviglio: BV ricorda ciuffi o una palla.
Reticolociti completamente reticolari: la sostanza basofila è rappresentata da una fitta rete;
Forme reticolate in modo incompleto: BV rimane come fili separati.
I reticolociti polverizzati sono piccoli granuli nelle cellule e sono una sostanza basofila.

“Gioventù” a breve termine

Non più dell'1% dei globuli rossi giovani circola nel sangue periferico degli adulti sani, che appartengono principalmente ai gruppi 4 e 5 (83%). I reticolociti dei gruppi 3 e 4 sono significativamente meno, insieme costituiscono circa il 18% e il gruppo 1 (cellule nucleari) generalmente compare solo in caso di rigenerazione potenziata.

Gli eritrociti rimangono in “giovane età” e sono chiamati reticolociti per un breve periodo: 30 - 40 ore del periodo assegnato non lasciano lo stroma del midollo osseo, formandovi una certa riserva di sangue rosso, e dopo la partenza, che è regolata principalmente dall'ormone glicoproteico umorale eritropoietina, che viaggia liberamente attraverso i vasi sanguigni per 35 - 45 ore. Nel sangue periferico, i reticolociti salutano finalmente la loro “giovinezza” - perdono il reticolo e vengono inviati a svolgere le funzioni principali di una cellula adulta, che, come accennato in precedenza, difficilmente può essere definita cellula - non ha un nucleo (“derivati cellulari”).

Necessaria la conta dei reticolociti!

In determinate circostanze, aumenta la produzione di globuli rossi nel midollo osseo, quindi aumenta il rilascio di forme giovani nel flusso sanguigno o, al contrario, l'inibizione dell'ematopoiesi inibirà il rilascio di reticolociti e quindi il loro numero nel sangue sarà ridotto . Un tentativo di valutare l'efficienza dell'eritropoiesi inizia solitamente con la conta dei globuli rossi appena rilasciati dal midollo osseo.

L'utilizzo della denominazione RET nell'analisi clinica è motivato anche dal sospetto di una maggiore distruzione dei globuli rossi nel sangue (emolisi). Tuttavia, scoprendo la causa della distruzione cellulare, sorge la domanda: come reagisce il midollo osseo a tali eventi, cerca di compensare le perdite con forme giovani o rimane indifferente? Inoltre, l’aumento (o la diminuzione) dei globuli rossi giovani può fornire informazioni sul comportamento del midollo osseo in altre circostanze:

L'uso di farmaci che influenzano il funzionamento del principale organo emopoietico (integratori di ferro, vitamina B 12 e terapia con acido folico);
Trattamento con eritropoietina, nota per controllare il rilascio di reticolociti dal midollo osseo);
Condizioni del midollo osseo dopo il trapianto di organi da donatore.

I reticolociti sono elevati: cosa significa?

Valori aumentati del contenuto di forme giovani nella popolazione di cellule eritrocitarie possono indicare la presenza di vari processi patologici e la reazione del midollo osseo alla loro presenza:

È improbabile che la perdita di sangue, soprattutto massiccia, non costringa un cervello sano a lavorare intensamente - dopotutto, le perdite devono essere reintegrate il prima possibile, quindi il numero di reticolociti può essere aumentato al 10 - 12% (‰ o 100 - 120 reticolociti per 1000 globuli rossi - 1/10).
Anche la distruzione dei globuli rossi dovuta all'ingresso di veleni emolitici o ad altre circostanze non lascerà "indifferente" il midollo osseo - la maggiore degradazione dei globuli rossi maturi aumenterà sicuramente la percentuale di forme giovani (a volte questa proporzione può raggiungere il 50%).
Una malattia così grave come l'anemia emolitica, che porta ad un aumento della RET fino al 300%, non passa inosservata, cioè non è più necessario cercare i reticolociti negli eritrociti, ma viceversa, poiché tutte le forme si sii giovane e gli adulti avranno il tempo di crollare.
La reticolocitosi è accompagnata anche da altre patologie ematologiche (policitemia, talassemia), nonché da metastasi al midollo osseo di neoplasie di varia localizzazione.
I valori dei reticolociti saranno aumentati in caso di ipossia acuta (mancanza di ossigeno) a causa di varie circostanze che possono perseguitare una persona dalla nascita alla vecchiaia.
Infezioni come la malaria possono causare un aumento del numero di cellule giovani.
Con un trattamento efficace con integratori di ferro per IDA si osserva reticolocitosi (dopo 1-2 settimane), un salto al 200% è possibile (crisi reticolocitica) circa una settimana dall'inizio delle misure terapeutiche in caso di anemia da carenza di folato B12.

Poco o niente

Un calo del livello dei reticolociti si osserva quando la linea eritrocitaria dell'ematopoiesi viene soppressa e la produzione di eritrociti a tutti gli effetti diminuisce per vari motivi, tra cui si possono distinguere i seguenti:

Anemia aplastica, in cui sono colpite tutte le linee dell'ematopoiesi;
Malattie renali che inibiscono la sintesi dell'eritropoietina, necessaria per regolare il rilascio di cellule giovani dal midollo osseo;
Malattie ematologiche autoimmuni;
Mancanza di vitamina B 12 e acido folico, che ha un effetto molto negativo sulla funzione del midollo osseo, poiché è necessario per la maturazione cellulare. In questo caso lo sviluppo si ferma a livello dell'eritroblasto: le cellule sono grandi, fragili, quindi non plastiche, e non hanno la capacità di penetrare nei capillari stretti (anemia megaloblastica);
Alcolismo (che tipo di rinnovamento del sangue esiste?);
Mixedema;
Metastasi di neoplasie dell'apparato scheletrico.

Finalmente

La ricerca e il conteggio dei reticolociti viene effettuata su 1000 globuli rossi, quindi si riferisce ad un esame del sangue generale. Se tutto è normale in una persona, allora non ha senso creare macchie separate e cercare forme giovani, che in questi casi non portano alcuna informazione. Un'altra cosa è che se si sospetta che qualcosa non va nella linea degli eritrociti, queste cellule possono, in una certa misura, chiarire la situazione.

Nel frattempo, in altri casi, percependo questo studio come separato, le persone chiedono come prepararsi all'analisi per ottenere un risultato affidabile. Tradizionalmente l'OAC viene somministrato a stomaco vuoto, per i reticolociti, e questo non è importante, quindi non c'è motivo di preoccuparsi. Inoltre, se viene prelevato sangue venoso per l'analisi o il test viene eseguito con un analizzatore automatico di alta qualità, non sarà necessario visitare il laboratorio una seconda volta. Tutto sarà annotato nell'esame del sangue generale.

Conta dei reticolociti

I reticolociti sono globuli rossi anucleati e immaturi, la cui maturazione avviene nel periodo successivo al rilascio nel sangue periferico dal midollo osseo. Il numero di reticolociti formati riflette l'attività eritropoietica del midollo osseo. In altre parole, il contenuto di reticolociti riflette il tasso di formazione dei globuli rossi e funge da indicatore della risposta del midollo osseo all’anemia.

reticolociti con contenuto medio di RNA (MFR%, frazione di reticolociti con fluorescenza media);

reticolociti ad alto contenuto di RNA (HFR%, frazione di reticolociti ad alta fluorescenza);

frazione di reticolociti immaturi (IRF%, frazione di reticolociti immaturi).

Contare i reticolociti in uno striscio dopo averli colorati con coloranti speciali

Il conteggio dei reticolociti in uno striscio dopo averli colorati con coloranti speciali è in pratica il metodo più utilizzato per contare il numero dei reticolociti. Ciò è dovuto al fatto che il metodo è semplice, abbastanza economico e non richiede attrezzature speciali e costose, e pertanto può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio diagnostico clinico.

Principio del metodo

Rilevazione della sostanza granulare-reticolare dei reticolociti durante la colorazione sopravitale con vernici alcaline con ulteriore conteggio in uno striscio di sangue.

Reagenti

Puoi utilizzare uno dei seguenti coloranti:

Una soluzione satura di blu cresilico brillante in alcool assoluto (per preparare l'alcol assoluto, è necessario immergere etanolo al 96% in diversi cambi di polvere di solfato di rame calcinato). Per 100 ml di alcol assoluto prendi 1,2 g di vernice.
Soluzione di azzurro I: azzurro I – 1 g, ossalato di ammonio – 0,4 g, cloruro di sodio – 0,8 g, alcool etilico 96% – 10 ml, acqua distillata – 90 ml. La soluzione di pittura in una bottiglia chiusa viene posta in un termostato a 37° C per 2-3 giorni e agitata vigorosamente periodicamente. Quindi raffreddare a temperatura ambiente e filtrare su un filtro di carta. La soluzione è conservata in un contenitore di vetro scuro. Se compaiono sedimenti, la vernice deve essere nuovamente filtrata.
Soluzione di Azur II: Azur II – 1 g, citrato di sodio – 5 g, cloruro di sodio – 0,4 g, acqua distillata – 45 ml. La soluzione viene lasciata in termostato a 37°C per 2 giorni, agitando di tanto in tanto. Per accelerare lo scioglimento, la vernice può essere riscaldata a fuoco basso per 15 - 20 minuti, senza portarla a ebollizione. Raffreddare a temperatura ambiente e filtrare. Conservare in contenitori di vetro scuro.

Equipaggiamento speciale

Progresso della determinazione

La colorazione dei reticolociti viene eseguita su vetro o in una provetta.

Colorazione dei reticolociti su vetro

Quando si colorano i reticolociti su vetro, un vetrino di vetro ben lavato e sgrassato viene riscaldato su una fiamma di bruciatore. Usando una bacchetta di vetro, applica sul vetro una goccia di uno dei coloranti sopra elencati e prepara una macchia di vernice utilizzando vetro smerigliato. Una vetrografia viene utilizzata per segnare il lato del vetro su cui viene applicata una macchia di vernice. In questa forma, il vetro può essere preparato per un uso futuro e conservato in un luogo asciutto e buio. Prima dell'analisi, preparare una camera umida. In genere, a questo scopo viene utilizzata una capsula Petri con rotoli di cotone idrofilo inumidito o carta da filtro posizionati attorno ai bordi. Applicare una goccia di sangue su una macchia di vernice, prepararne una sottile macchia e posizionarla immediatamente in una camera umida per 3-10 minuti. Quindi gli strisci vengono asciugati all'aria.

Colorazione dei reticolociti in vitro

La colorazione dei reticolociti in una provetta differisce quando vengono utilizzati coloranti diversi.

Metodo 1 – colorazione dei reticolociti in una provetta con blu cresile brillante.

Prima dell'uso, preparare in una provetta una soluzione di lavoro di blu cresilico brillante composta da una goccia di soluzione di ossalato di potassio all'1% e 4 gocce di soluzione di vernice blu cresilico brillante. Aggiungere 0,04 ml di sangue alla vernice (due pipette fino alla tacca 0,02). La miscela viene miscelata accuratamente ma delicatamente e lasciata per 30 minuti. Quindi mescolare di nuovo e preparare strisci sottili.

Metodo 2 - colorazione dei reticolociti in una provetta con Azur II.

Metodo 3 - colorazione dei reticolociti in una provetta con Azure I.

Attualmente sono disponibili in commercio coloranti già pronti per i reticolociti, prodotti in fabbrica. I reticolociti vengono colorati utilizzandoli secondo le istruzioni allegate.

Conta dei reticolociti.

Gli strisci preparati utilizzando uno dei metodi sopra indicati vengono esaminati al microscopio utilizzando una lente ad immersione. Nello striscio, i reticolociti e gli eritrociti sono di colore giallo-verdastro, la sostanza granulare-filamentosa nei reticolociti è blu (se colorata con azzurro II e blu cresilo brillante) o viola-bluastra (se colorata con azzurro I).

Foto dei reticolociti:

Trova i campi visivi in cui si trovano i globuli rossi separatamente. In questi campi visivi è necessario contare almeno 1000 globuli rossi e annotare tra questi il numero di globuli rossi contenenti una sostanza granulare-filamentosa. Una maggiore precisione si ottiene contando 2000 - 3000 globuli rossi.

A causa del fatto che nel campo visivo è presente un gran numero di globuli rossi, il che rende difficile il conteggio, è necessario limitare (ridurre) il campo visivo. Per fare ciò, è possibile utilizzare un oculare speciale, in cui è possibile ridurre il campo visivo alla dimensione richiesta, oppure utilizzare una "finestra" speciale (un cerchio con un diametro leggermente più piccolo dell'oculare viene ritagliato dalla carta, si ritaglia un piccolo diamante al centro del cerchio e la finestra risultante viene inserita nell'oculare).

Il numero di reticolociti contati è espresso per 100 (in percentuale) o per 1000 (in ppm) di globuli rossi.

Esempio: Quando si contano 1000 globuli rossi in uno striscio, è stato rivelato che 15 globuli rossi su 1000 hanno una sostanza a rete granulare di vario grado, cioè sono reticolociti. Pertanto, il numero di reticolociti in questo caso è dell'1,5% o 15‰.

Letteratura:

Directory "Metodi di ricerca di laboratorio in clinica" a cura di Menshikov V.V. - Mosca, "Medicina", 1987
Lyubina A. Ya., Ilyicheva L. P. e coautori - “Studi clinici di laboratorio” - Mosca, “Medicina”, 1984.

Conta dei reticolociti mediante microscopia a fluorescenza

Il metodo per contare il numero dei reticolociti utilizzando la microscopia a fluorescenza è semplice, richiede poco tempo ed è più accurato del metodo convenzionale, poiché la microscopia a fluorescenza rivela i grani più piccoli di una sostanza filamentosa reticolare.

Reticolociti

Inclusioni patologiche nei globuli rossi

I corpi jolly (corpi Howell-Jolly) sono piccole inclusioni rotonde viola-rosse di dimensioni µm, presenti 1 (meno spesso 2 - 3) in un eritrocita. Rappresentano il resto del nucleo dopo la rimozione delle FER. Si rilevano con intensa emolisi e “sovraccarico” del RES, dopo splenectomia, con anemia megaloblastica.

Studio citochimico dei lipidi

Lo studio citochimico dei lipidi si basa sull'uso di coloranti liposolubili (sudan III, sudan IV, black sudan, ecc.). Per identificare il grasso neutro si utilizza il Sudan III, che colora il grasso di arancione. I lipidi vengono rilevati meglio dal Sudan Black (colorazione nera).

Analisi delle urine secondo Nechiporenko

Il metodo Nechiporenko nella diagnostica di laboratorio domestica è il metodo più comune per la determinazione quantitativa degli elementi formati nelle urine. Questo metodo è il più semplice, accessibile a qualsiasi laboratorio e conveniente nella pratica ambulatoriale e presenta anche numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi quantitativi noti per lo studio del sedimento urinario. Utilizzando il metodo Nechiporenko, viene determinato il numero di elementi formati (eritrociti, leucociti e cilindri) in 1 ml di urina.

Contare i reticolociti in uno striscio di sangue (quantità)

Cosa sono i reticolociti?

I reticolociti sono forme giovani di eritrociti (precursori degli eritrociti maturi), contenenti una sostanza granulare-filamentosa, rivelata da una colorazione speciale (sopravitale). I reticolociti vengono rilevati sia nel midollo osseo che nel sangue periferico. Il tempo di maturazione dei reticolociti è di 4-5 giorni, di cui entro 3 giorni maturano nel sangue periferico, dopodiché diventano eritrociti maturi. Nei neonati i reticolociti si trovano in numero maggiore rispetto agli adulti.

Il numero di reticolociti nel sangue riflette le proprietà rigenerative del midollo osseo. Il loro conteggio è importante per valutare il grado di attività dell'eritropoiesi (produzione di globuli rossi): quando l'eritropoiesi accelera, la proporzione dei reticolociti aumenta e quando rallenta diminuisce. In caso di maggiore distruzione dei globuli rossi, la percentuale di reticolociti può superare il 50%. Una forte diminuzione del numero di globuli rossi nel sangue periferico può portare ad un aumento artificiale del numero di reticolociti, poiché quest'ultimo è calcolato come percentuale di tutti i globuli rossi. Pertanto, per valutare la gravità dell'anemia, viene utilizzato l'“indice reticolare”: % reticolociti x ematocrito / 45 x 1,85, dove 45 è un ematocrito normale, 1,85 è il numero di giorni necessari affinché nuovi reticolociti entrino nel sangue. Se indice< 2 – говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, если >2-3, poi c'è un aumento della formazione dei globuli rossi.

Indicazioni ai fini dell'analisi:

diagnosi di emopoiesi inefficace o diminuzione della produzione di globuli rossi;
diagnosi differenziale dell'anemia;
valutazione della risposta alla terapia con ferro, acido folico, vitamina B12, eritropoietina;
monitorare l'effetto del trapianto di midollo osseo;
monitoraggio della terapia eritrosoppressore.
Preparazione allo studio: lo studio viene effettuato a stomaco vuoto o almeno 2 ore dopo
l'ultimo pasto, quando si preleva il sangue, è necessario evitare la compressione prolungata della vena con un laccio emostatico.

Quando aumenta il numero dei reticolociti (reticolocitosi)?

Anemia postemorragica (crisi reticolocitaria, aumento 3-6 volte).
Anemia emolitica (fino al 300%).
Mancanza acuta di ossigeno.
Trattamento dell'anemia da carenza di vitamina B12 (crisi dei reticolociti e terapia con vitamina B12).
Terapia dell'anemia sideropenica con preparati a base di ferro (giorno del trattamento).
Talassemia.
Malaria.
Policitemia.
Metastasi tumorali al midollo osseo.

Quando diminuisce la conta dei reticolociti?

Anemia aplastica.
Anemia ipoplastica.
Anemia da carenza di vitamina B12 non trattata.
Metastasi di neoplasie ossee.
Malattie autoimmuni del sistema emopoietico.
Mixedema.
Malattie renali.
Alcolismo.

Reticolociti

I reticolociti sono globuli rossi giovani che si formano dopo che i normoblasti perdono i loro nuclei. Una caratteristica dei reticolociti è la presenza nel citoplasma di una sostanza granulare-filamentosa che rappresenta ribosomi e mitocondri aggregati. Questa sostanza viene rilevata utilizzando uno speciale metodo di colorazione: sopravitale (intravitale), ad es. senza fissazione preliminare delle cellule. La sostanza granulare-filamentosa in vari reticolociti è caratterizzata da polimorfismo; Più giovane è la cellula, più abbondante è la sostanza. Nei reticolociti più giovani ha la forma di una palla spessa; nelle cellule più mature si presenta sotto forma di rete, di singoli fili e poi di singoli granelli. Negli strisci colorati con metodi ematologici convenzionali, i reticolociti sono di colore rosa-grigiastro - policromatofili, cioè colorati con coloranti diversi.

Il numero di reticolociti è determinato mediante microscopia di strisci appositamente colorati

3.2.1 Metodo di colorazione degli strisci di sangue per reticolociti secondo Alekseev (conteggio secondo Fonio)

Principio: il metodo si basa sul conteggio del numero di reticolociti negli strisci di sangue colorati per 1000 globuli rossi. Vengono preparati due strisci contemporaneamente (per piastrine e reticolociti).

Reagente: soluzione di verniciatura funzionante secondo Alekseev

Procedura di determinazione: una soluzione di lavoro viene introdotta nel capillare per determinare la VES fino alla tacca di 0,75 µl e un capillare pieno di sangue viene prelevato da una puntura del dito del paziente. Il rapporto tra colorante e sangue è 1:4. La miscela viene lasciata per 2 ore, quindi viene fatto uno striscio sottile su un vetrino. Lo striscio viene asciugato all'aria ed esaminato al microscopio ad immersione.

Il conteggio viene effettuato come segue: le griglie di reticolociti sono colorate in blu. Quando si contano i globuli rossi, viene contato il numero di reticolociti nel campo visivo. Vengono contati 1000 globuli rossi. Il risultato è espresso in percentuale.

Valore standard: il sangue di una persona sana contiene 0,2-1,0%

(o 2-10 anche fino a 12 ppm) reticolociti

Significato clinico e diagnostico: la comparsa di reticolociti nel sangue periferico indica un aumento della funzionalità del midollo osseo e viene utilizzata nella valutazione di vari tipi di anemia.

Un aumento del numero di reticolociti si osserva dopo la perdita di sangue, con anemia emolitica

Reticolocitosi grave - osservata con ittero emolitico

Una diminuzione del numero di reticolociti in presenza di anemia indica un tipo di emopoiesi aplastica.

In base al livello dei reticolociti nel sangue, l’anemia si divide in:

Rigenerativo (il numero di reticolociti è dello 0,5-5% - questa è l'anemia postemorragica);

Iperrigenerativo (il numero di reticolociti superiore al 5% è l'anemia emolitica);

Ipo- e aregenerativi (il numero dei reticolociti è ridotto o sono assenti, nonostante l'anemia grave - anemia ipo- e aplastica, carenza di ferro e B12).

Metodo sopravitale per la colorazione dei reticolociti.

Rilevazione della sostanza granulare-reticolare dei reticolociti colorati con blu cresile brillante senza previa fissazione.

Soluzione all'1% di blu cresilico brillante: in 5 ml di soluzione fisiologica si sciolgono 50 mg di colorante e si aggiungono 20 mg di citrato di sodio (la soluzione si conserva in un contenitore di vetro scuro, buona per diversi giorni).

Applicare 2 gocce di una soluzione all'1% di vernice blu cresile brillante e 1 goccia di sangue su un vetrino dotato di pozzetto. Mescolare accuratamente con una bacchetta di vetro e il composto viene posto in una camera umida (piastra Petri, nella quale vengono posti sui bordi rotoli di garza o cotone idrofilo leggermente inumiditi) per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi gli strisci vengono realizzati e asciugati.

Negli strisci, i globuli rossi sono colorati di verde-giallastro e la sostanza granulare-reticolare nei reticolociti è blu e viola.

Gli strisci vengono esaminati al microscopio con una lente ad immersione. I reticolociti vengono contati per 1000 globuli rossi (una maggiore precisione si ottiene quando si contano i globuli rossi).

Aumento della conta dei reticolociti osservato quando:

stimolazione dell'eritropoiesi (perdita di sangue, emolisi, crisi reticolocitaria con trattamento efficace dell'anemia da carenza di vitamina B12, mancanza acuta di ossigeno).

Diminuzione della conta dei reticolociti osservato quando:

inibizione dell'eritropoiesi (anemia aplastica e ipoplastica, anemia da carenza di vitamina B12 non trattata, metastasi tumorali nelle ossa),

malattie renali, malattie endocrine.

METODI PER IL CONTEGGIO DEL NUMERO DEI RETICOLOCITI

(1) Contare il numero di reticolociti in uno striscio dopo averli colorati con coloranti speciali. Questo metodo è in pratica il metodo più utilizzato perché è semplice, abbastanza economico e non richiede attrezzature speciali costose e di conseguenza può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio diagnostico clinico. Il principio del metodo si basa sull'identificazione della sostanza granulare-reticolare dei reticolociti durante la colorazione sopravitale con vernici alcaline (soluzione satura di blu cresilico brillante in alcool assoluto / soluzione Azur I / soluzione Azur II) con ulteriore conteggio in uno striscio di sangue. La colorazione dei reticolociti viene eseguita su vetro o in una provetta. Il conteggio viene effettuato utilizzando un microscopio: gli strisci preparati utilizzando uno dei metodi sopra indicati vengono esaminati al microscopio con una lente ad immersione; nello striscio, reticolociti ed eritrociti sono di colore giallo-verdastro, la sostanza granulare-filamentosa nei reticolociti è blu (se colorata con azzurro II e blu cresilo brillante) o viola-bluastra (se colorata con azzurro I). (2) Conteggio dei reticolociti mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo è semplice e richiede poco tempo, è più accurato del metodo convenzionale, poiché la microscopia a fluorescenza rivela i grani più piccoli di una sostanza filamentosa a rete, ma è possibile solo con un microscopio a fluorescenza e coloranti speciali, ed è quindi disponibile solo ad alcuni laboratori. Il principio del conteggio del numero di reticolociti mediante microscopia a fluorescenza si basa sulla capacità della sostanza reticolocitaria di fluorescere dopo aver trattato il sangue con arancio di acridina. Il sangue viene miscelato con l'arancia di acridina in una provetta o in un mixer in un rapporto di 1 parte di sangue e 10 parti di vernice (la miscela può essere conservata per non più di 5 ore). La miscela viene agitata per 2 minuti, una goccia della miscela viene applicata su un vetrino e coperta con un coprioggetto. In questo caso il liquido non deve oltrepassare il coprioggetto. Microscopia utilizzando un filtro luminoso ZhS-17. Nella preparazione, i globuli rossi hanno contorni verde scuro e non emettono fluorescenza, e nei reticolociti la sostanza a maglia granulare si illumina di rosso brillante, rendendo i reticolociti facili da contare. Nel sangue stabilizzato con eparina o citrato di sodio non si osserva fluorescenza dei reticolociti. (3) Conta automatica dei reticolociti mediante analizzatore ematologico. Nei moderni analizzatori ematologici, la tecnologia per il conteggio delle cellule del sangue si basa sul metodo conduttometrico proposto da H. Wallace e Joseph R. Culter nel 1947. Il principio del metodo è contare il numero e determinare la natura degli impulsi che si verificano quando una cellula passa attraverso un foro (apertura) di piccolo diametro, su entrambi i lati del quale sono presenti due elettrodi isolati gli uni dagli altri. Ogni passaggio di una cellula attraverso l'apertura è accompagnato dalla comparsa di un impulso elettrico, che viene registrato da un sensore elettronico. La divisione delle cellule in categorie (eritrociti, leucociti, piastrine, sedimento) viene effettuata dall'apparecchio sulla base dell'analisi dell'ampiezza degli impulsi ricevuti.Per determinare la concentrazione delle cellule è sufficiente far passare un certo volume di campione attraverso il canale e contare il numero di impulsi generati. Va notato che oltre al parametro classico dei reticolociti - il contenuto relativo (%) di reticolociti (RET%, percentuale di reticolociti), determinato utilizzando i metodi 1 e 2 della diagnostica di laboratorio, in connessione con l'avvento dell'alta tecnologia analizzatori ematologici (metodo 3) è diventato possibile ottenere (ad esempio, utilizzando un colorante fluorescente brevettato per l'analizzatore Sysmex -XT- 2000i) ulteriori parametri informativi dei reticolociti: reticolociti con un basso contenuto di RNA, i più maturi (LFR%, bassa fluorescenza frazioni reticolocitarie); reticolociti con contenuto medio di RNA (MFR%, frazioni reticolocitarie a fluorescenza media) - frazione di reticolociti con fluorescenza media); reticolociti ad alto contenuto di RNA (HFR%, frazioni di reticolociti ad alta fluorescenza) - una frazione di reticolociti ad alta fluorescenza); frazione di reticolociti immaturi (IRF%, frazione di reticolociti immaturi). La differenziazione dei reticolociti, in base al grado di maturità e, di conseguenza, al contenuto di acidi nucleici, è un riflesso dell'attività ematopoietica del midollo osseo. Metodologia (analizzatore Sysmex -XT- 2000i). In una cella a flusso, le cellule attraversano un raggio laser a semiconduttore, provocando la diffusione del raggio ad alto e basso angolo e l'eccitazione di un colorante fluorescente. Ciò consente di determinare i diversi stadi di maturità dei reticolociti in base al contenuto di RNA nelle cellule e all'intensità della loro luminescenza. Il conteggio automatizzato dei reticolociti è estremamente accurato (vengono contati più globuli rossi) e riproducibile (il coefficiente di variazione è di circa il 6%). Questa tecnologia garantisce un conteggio accurato dei reticolociti anche a concentrazioni estremamente basse.

Reticolocitopenia e reticolocitosi, cause dello sviluppo, valore diagnostico della loro rilevazione.

Reticolociti

I reticoloti sono globuli rossi giovani che si formano dopo che i normoblasti perdono i loro nuclei. Una caratteristica dei reticolociti è la presenza nel citoplasma di una sostanza granulare-filamentosa che rappresenta ribosomi e mitocondri aggregati. Questa sostanza viene rilevata utilizzando uno speciale metodo di colorazione: sopravitale, ad es. senza fissazione preliminare delle cellule. La sostanza granulare-filamentosa in vari reticolociti è caratterizzata da polimorfismo: più giovane è la cellula, più abbondante è la sostanza. Nei reticolociti più giovani ha la forma di una palla spessa; nelle cellule più mature si presenta sotto forma di rete, di singoli fili e poi di singoli granelli. Negli strisci colorati con metodi ematologici convenzionali, i reticolociti sono di colore rosa-grigiastro - policromatofili, cioè colorati con coloranti diversi.

Il numero di reticolociti è determinato mediante microscopia di strisci appositamente colorati.

Metodo unificato per contare il numero dei reticolociti dopo averli colorati con blu cresilico brillante, azzurro I o azzurro II direttamente su vetro o in provetta (1972).

Colorazione sopravitale con coloranti che rivelano la sostanza granulare-filamentosa dei reticolociti.

Reagenti. Puoi utilizzare uno dei seguenti coloranti.

1. Una soluzione satura di blu cresilico brillante in alcool assoluto (per preparare l'alcol assoluto, è necessario immergere etanolo al 96% in diversi cambi di polvere di solfato di rame calcinato). Per 100 ml di alcol assoluto prendi 1,2 g di vernice.

2. Soluzione di azzurro I, proposta da P.N. Korikov: azzurro 1 - 1 g, ossalato di ammonio - 0,4 g, cloruro di sodio - 0,8 g, alcool etilico 96% 10 ml, acqua distillata - 90 ml. La soluzione di pittura in una bottiglia chiusa viene posta in un termostato a 37 °C per 2-3 giorni e agitata vigorosamente periodicamente. Quindi raffreddare a temperatura ambiente e filtrare su un filtro di carta. La soluzione è conservata in un contenitore di vetro scuro. Se compaiono sedimenti, la vernice deve essere nuovamente filtrata.

3. Soluzione di Azur II con la seguente composizione: Azur II 1 g, citrato di sodio 5 g, cloruro di sodio 0,4 g, acqua distillata 45 ml. La soluzione viene lasciata in termostato a 37°C per 2 giorni, agitando di tanto in tanto. Per accelerare lo scioglimento, la vernice può essere riscaldata a fuoco basso per un minuto, senza portarla a ebollizione. Raffreddare a temperatura ambiente e filtrare). Conservare in contenitori di vetro scuro.

Equipaggiamento speciale. Microscopio.

Un vetrino di vetro ben lavato e sgrassato viene riscaldato sulla fiamma di un bruciatore. Usando una bacchetta di vetro, applica una goccia di uno dei coloranti sul vetro e prepara una macchia di vernice usando il vetro smerigliato. Segnare il lato del vetro su cui viene applicato il tratto di vernice con uno steklograf. In questa forma, il vetro può essere preparato per un uso futuro e conservato in un luogo asciutto e buio. Applicare una goccia di sangue su una macchia di vernice, preparare uno striscio sottile e posizionarlo immediatamente in una camera umida per 3-4 minuti (è possibile utilizzare una capsula Petri con rotoli di cotone idrofilo inumidito o carta da filtro posizionati lungo i bordi ). Quindi gli strisci vengono asciugati all'aria.

Negli strisci preparati in questo modo, i globuli rossi sono di colore giallastro-verdastro e la sostanza granulare-filamentosa è blu.

Metodo 1: prima dell'uso, preparare in una provetta una soluzione di lavoro di blu cresilico brillante composta da una goccia di soluzione di ossalato di potassio all'1% e 4 gocce di soluzione di vernice 1. Aggiungere 0,04 ml di sangue alla vernice (due pipette a 0,02 segno). La miscela viene miscelata accuratamente ma delicatamente e lasciata per 30 minuti. Mescolare e preparare strisci sottili.

Metodo 2: 0,05 ml di soluzione colorante 3 e 0,2 ml di sangue vengono posti in una provetta. La miscela viene accuratamente miscelata e lasciata riposare. Mescolare e preparare strisci sottili.

Metodo 3: 0,3-0,5 ml della soluzione di pittura 2 e 5-6 gocce di sangue vengono posti in una provetta utilizzando una pipetta dell'apparato Panchenkov. La provetta viene coperta con un tappo di gomma, la miscela viene miscelata accuratamente ma accuratamente e lasciata per 1-2 ore (i reticolociti si colorano meglio con un'esposizione di 2-3 ore). Mescolare e preparare strisci sottili.

Negli strisci, i globuli rossi sono di colore giallastro-verdastro, la sostanza granulare-filamentosa è blu o viola-bluastra.

Gli strisci preparati utilizzando uno dei metodi sopra indicati vengono esaminati al microscopio utilizzando una lente ad immersione. È necessario contare almeno 1000 globuli rossi e annotare tra questi il numero di globuli rossi contenenti una sostanza granulare-filamentosa. In pratica, per una maggiore precisione, viene utilizzato un oculare speciale, in cui il campo visivo può essere ridotto alla dimensione richiesta. Per strisci sottili e uniformi in cui i globuli rossi si trovano in una fila, selezionare un campo visivo in cui sono presenti, ad esempio, 50 globuli rossi, quindi calcolare 20 campi visivi di questo tipo.

Se non disponi di un oculare già pronto, puoi prepararlo facilmente svitando l'oculare 10X, inserendo un pezzo di carta con un quadratino ritagliato e avvitandolo.

Il numero di reticolociti contati è espresso per 1000 o per 100 globuli rossi.

Conteggio del numero di reticolociti mediante microscopia a fluorescenza.

Utilizzo della capacità della sostanza reticolocitaria di fluorescere dopo aver trattato il sangue con arancia di acridina.

1. Una soluzione di arancio di acridina in una soluzione isotonica di cloruro di sodio e una concentrazione di 1:5000. Per preparare una soluzione isotonica si consiglia di utilizzare acqua distillata pH 5,8-6,8.La soluzione di arancia acridina deve essere fresca; conservarlo per non più di 3-5 giorni in una bottiglia scura con tappo smerigliato.

2. Olio da immersione non fluorescente.

È possibile utilizzare afluol o un normale olio da immersione con fluorescenza attenuata dal nitrobenzene (0,3 ml di nitrobenzene per 1 ml di olio). Yu N. Zubrzhitsky suggerisce di utilizzare l'anisolo distillato come olio non fluorescente.

Equipaggiamento speciale. Microscopio ultravioletto MUF-ZM o luminescente.

Il sangue viene miscelato con l'arancia di acridina in una provetta o in un mixer in un rapporto di 1 parte di sangue e 10 parti di vernice (la miscela può essere conservata per non più di 5 ore). La miscela viene agitata per 2 minuti, una goccia della miscela viene applicata su un vetrino e coperta con un coprioggetto.

Microscopia utilizzando un filtro luminoso ZhS-17.

Nella preparazione, i globuli rossi non emettono fluorescenza, ma nei reticolociti la sostanza granulare-filamentosa si illumina di rosso vivo.

È stato notato che nel sangue stabilizzato con eparina o citrato di sodio non si osserva fluorescenza dei reticolociti.

Il metodo è semplice e richiede poco tempo; Grazie alla luce brillante, i reticolociti sono facili da contare.

Valori normali. Nelle persone sane, il numero di reticolociti è per miglio, ovvero 0,2-1,2%.

Il numero di reticolociti nel sangue riflette le proprietà rigenerative del midollo osseo e la sua valutazione è ampiamente utilizzata in varie anemie (vedi Tabella 24). Un aumento del numero dei reticolociti si osserva dopo la perdita di sangue, nell'anemia emolitica, soprattutto durante una crisi (il numero dei reticolociti può aumentare), così come durante il trattamento dell'anemia di Addison Birmer con vitamina B12 (crisi dei reticolociti - aumento dei il numero di reticolociti al 4-8° giorno di trattamento). Una diminuzione del numero dei reticolociti è caratteristica dell'anemia ipoplastica, recidiva dell'anemia di Addison-Birmer

La determinazione della conta dei reticolociti può essere utilizzata per determinare la produzione di eritropoiesi e calcolare la durata della vita dei globuli rossi.

Letteratura. Gomzyakova N.V. Lab, caso, 1960, n. 5, pag. 38-39;

Zubzhitsky Yu.N. Lab. caso; 1967, n. 2, pag. 35;

Conta dei reticolociti

Principio. Colorazione sopravitale con coloranti che rivelano la sostanza granulare-reticolare dei reticolociti.

Progresso della determinazione. Dipinto su vetro. Un vetrino di vetro ben lavato e sgrassato viene riscaldato sulla fiamma di un bruciatore.

Negli strisci preparati in questo modo, i globuli rossi sono di colore giallastro-verdastro e la sostanza a rete granulare è blu.

Colorazione in vitro. Metodo 1: prima dell'uso, preparare in una provetta una soluzione di lavoro di blu cresilico brillante composta da 1 goccia di soluzione di ossalato di potassio all'1% e 4 gocce di soluzione di vernice (reagente 1). Aggiungere 0,04 ml di sangue alla vernice (due pipette fino alla tacca 0,02). La miscela viene miscelata accuratamente ma delicatamente e lasciata per 30 minuti. Mescolare e preparare strisci sottili.

Conta dei reticolociti. Negli strisci, i globuli rossi sono di colore giallastro-verdastro, la sostanza a rete granulare è blu o viola-bluastra.