Metodo per la determinazione dei gruppi sanguigni. Caratteristiche del test di Coombs diretto e interpretazione dei risultati Il test di Coombs è positivo, il che significa

- un test dell'antiglobulina volto a rilevare nel sangue Rh-negativo anticorpi anti-eritrociti incompleti contro il fattore Rh - una proteina specifica che si trova sulla superficie degli eritrociti del sangue Rh-positivo. Esistono due tipi di questo test: diretto - rilevamento di anticorpi sulla superficie dei globuli rossi, indiretto - rilevamento di anticorpi nel siero del sangue. Un test diretto viene effettuato nella diagnosi e nel monitoraggio del trattamento delle malattie del sangue: anemia emolitica, malattia emolitica del neonato e altre. Viene eseguito un test indiretto per valutare la compatibilità del sangue del donatore e del ricevente durante la trasfusione, nonché per determinare la presenza e il rischio di conflitto Rh durante la pianificazione e la gestione della gravidanza. Il materiale per il test di Coombs è il sangue venoso, lo studio viene effettuato con metodi basati sulla reazione di agglutinazione. Normalmente, entrambi i test danno un risultato negativo. L'analisi viene eseguita entro un giorno.

Il test di Coombs è un esame clinico del sangue Rh-negativo, volto a rilevare gli anticorpi contro il fattore Rh. Il test viene utilizzato per identificare il rischio di sviluppare un conflitto Rhesus e reazioni emolitiche. In ogni persona, la superficie degli eritrociti contiene un certo insieme di antigeni o agglutinogeni - composti di varia natura, la cui presenza o assenza viene utilizzata per giudicare il gruppo sanguigno e il fattore Rh. Esistono molti tipi di antigeni, nella pratica medica, gli agglutinogeni A e B, che determinano il gruppo sanguigno, e l'agglutinogeno D, il fattore Rh, sono della massima importanza pratica. Con un fattore Rh positivo, gli antigeni D vengono rilevati sulla membrana esterna degli eritrociti, con un negativo - no.

Il test di Coombs, chiamato anche test dell'antiglobulina, ha lo scopo di rilevare anticorpi anti-eritrociti incompleti contro il sistema del fattore Rh nel sangue. Gli anticorpi contro il fattore Rh sono immunoglobuline specifiche che vengono prodotte nel sangue Rh-negativo quando vi entrano eritrociti con agglutinogeni D. Ciò può accadere quando il sangue del feto e quello della donna incinta vengono mescolati, con trasfusioni di sangue effettuate senza una precedente tipizzazione del sangue. Il test di Coombs esiste in due versioni: diretta e indiretta. Quando si esegue un test di Coombs diretto, gli anticorpi vengono rilevati attaccati alla superficie dei globuli rossi. Lo studio viene utilizzato per determinare la causa della reazione emolitica. Il test indiretto di Coombs ha lo scopo di rilevare gli anticorpi anti-eritrociti nel plasma sanguigno. È necessario determinare la compatibilità del sangue del donatore e del ricevente o della madre e del feto, aiuta a prevenire lo sviluppo del conflitto Rhesus e la successiva emolisi dei globuli rossi.

Il sangue per entrambe le varianti del test di Coombs viene prelevato da una vena. L'analisi viene eseguita con il metodo dell'agglutinazione utilizzando siero antiglobulina. I risultati dello studio sono utilizzati in ematologia per identificare le cause delle reazioni emolitiche, in chirurgia e rianimazione durante le trasfusioni di sangue, in ostetricia e ginecologia nel monitoraggio delle gravidanze nelle donne con sangue Rh negativo.

Indicazioni

Il test diretto di Coombs, che rileva gli anticorpi attaccati alla superficie dei globuli rossi, è prescritto per le reazioni emolitiche (distruzione dei globuli rossi) di varia origine. Lo studio è indicato per l'anemia emolitica autoimmune primaria, l'anemia emolitica post-trasfusionale, la malattia emolitica del neonato, l'emolisi dei globuli rossi causata da malattie autoimmuni, neoplastiche o infettive, nonché l'assunzione di farmaci, ad esempio chinidina, metildopa, procainamide . Il test indiretto di Coombs, che rileva gli anticorpi nel plasma sanguigno, viene utilizzato per prevenire lo sviluppo del conflitto Rhesus. È indicato per i pazienti in preparazione a trasfusioni di sangue, nonché per le donne in gravidanza con fattore Rh negativo, a condizione che il futuro padre del bambino abbia un fattore Rh positivo.

Per determinare la compatibilità Rh, il test di Coombs non viene somministrato a pazienti con sangue Rh positivo. In questi casi sono già presenti antigeni sulla superficie dei globuli rossi, la produzione di anticorpi non può essere innescata dalla trasfusione di sangue o dall'ingresso di sangue fetale nel flusso sanguigno della donna incinta. Inoltre, lo studio non è indicato per le donne in gravidanza se entrambi i genitori hanno un fattore Rh negativo, un carattere recessivo ereditario. Un bambino in tali coppie ha sempre sangue Rh negativo, un conflitto immunologico con la madre è impossibile. Nelle patologie emolitiche, il test dell'antiglobulina non viene utilizzato per monitorare il successo della terapia, poiché i risultati non riflettono l'attività del processo di distruzione degli eritrociti.

Il limite del test di Coombs è la complessità della procedura di ricerca: per ottenere risultati affidabili, è necessario rispettare le condizioni di temperatura e tempo, le regole per la preparazione dei reagenti e del biomateriale. Il vantaggio del test di Coombs è la sua elevata sensibilità. Nell'anemia emolitica, i risultati di questo test rimangono positivi, anche se l'emoglobina, la bilirubina e i reticolociti tornano alla normalità.

Preparazione per l'analisi e la raccolta del materiale

Il materiale per eseguire il test di Coombs è il sangue venoso. Non ci sono requisiti particolari per il tempo della procedura di prelievo del sangue e per la preparazione del paziente. Come con qualsiasi studio, si consiglia di fare una pausa dopo aver mangiato per almeno 4 ore e negli ultimi 30 minuti smettere di fumare, fare esercizio fisico ed evitare lo stress emotivo. Vale anche la pena discutere in anticipo con il proprio medico della necessità di interrompere l'assunzione di farmaci: alcuni farmaci possono distorcere i risultati del test di Coombs. Il sangue viene prelevato con una siringa dalla vena cubitale, meno spesso da una vena sul dorso della mano. Nel giro di poche ore il materiale viene consegnato al laboratorio.

Quando si esegue un test di Coombs diretto, il siero dell'antiglobulina viene aggiunto al siero del sangue del paziente. Dopo qualche tempo, la miscela viene esaminata per la presenza di agglutinati: si formano se ci sono anticorpi sui globuli rossi. Con un risultato positivo, viene determinato un titolo agglutinante. Il test di Coombs indiretto consiste in più passaggi. In primo luogo, gli anticorpi presenti nel siero vengono fissati sugli eritrociti iniettati durante l'incubazione. Quindi il siero antiglobulina viene aggiunto al campione, dopo un po 'vengono determinati la presenza e il titolo degli agglutinati. Il periodo di analisi è di 1 giorno.

Risultati normali

Normalmente il risultato del test di Coombs diretto è negativo (-). Ciò significa che non ci sono anticorpi associati ai globuli rossi nel sangue e non possono essere la causa dell'emolisi. Anche il risultato normale del test di Coombs indiretto è negativo (-), cioè non ci sono anticorpi contro il fattore Rh nel plasma sanguigno. Quando si prepara una trasfusione di sangue per il ricevente, ciò significa compatibilità con il sangue del donatore, durante il monitoraggio della gravidanza: l'assenza di sensibilizzazione Rh della madre, un basso rischio di sviluppare un conflitto immunologico. I fattori fisiologici, come le abitudini alimentari o l'attività fisica, non possono influenzare il risultato del test. Pertanto, se il risultato è positivo, è necessaria la consultazione di un medico.

Valore diagnostico dell'analisi

Un risultato positivo al test di Coombs è espresso qualitativamente, da (+) a (++++), o quantitativamente, in titoli da 1:16 a 1:256. La determinazione della concentrazione di anticorpi sugli eritrociti e nel siero del sangue viene eseguita in entrambi i tipi di campioni. Con un risultato positivo del test di Coombs diretto, gli anticorpi vengono rilevati sulla membrana esterna dei globuli rossi, che portano alla distruzione di questi globuli. La causa potrebbe essere una trasfusione di sangue senza una tipizzazione preventiva: una reazione emolitica post-trasfusione, così come l'eritroblastosi neonatale, una reazione emolitica dovuta all'uso di droghe, anemia emolitica autoimmune primaria o secondaria. La distruzione secondaria degli eritrociti può essere causata da lupus eritematoso sistemico, sindrome di Evans, macroglobulinemia di Waldenström, emoglobinuria parossistica da freddo, leucemia linfatica cronica, linfoma, mononucleosi infettiva, sifilide, polmonite da micoplasma.

Un risultato positivo del test di Coombs indiretto indica la presenza di anticorpi contro il fattore Rh nel plasma. In pratica, ciò significa che si è verificata la sensibilizzazione Rh, esiste la possibilità di sviluppare un conflitto Rh dopo l'infusione di sangue del donatore durante la gravidanza. Per prevenire complicazioni durante la gravidanza, le donne con risultato positivo al test di Coombs vengono inserite in registri speciali.

Trattamento delle deviazioni dalla norma

Il test di Coombs fa riferimento a studi isoserologici. I suoi risultati consentono di identificare una reazione emolitica, nonché di determinare la compatibilità del sangue del donatore e del ricevente, madre e feto, al fine di prevenire lo sviluppo del conflitto Rhesus. Se il risultato del test è positivo, è necessario chiedere consiglio al medico curante: ostetrico-ginecologo, ematologo, chirurgo.

- uno studio che aiuta a determinare il contenuto di anticorpi anti-eritrociti incompleti nel sangue. Tale test dell'antiglobulina consente di rilevare gli anticorpi nelle donne in gravidanza.

Inoltre, consente di diagnosticare l'anemia emolitica nei neonati con conflitto Rhesus nelle fasi iniziali. Questo aiuta a prevenire la distruzione dei globuli rossi necessari per la normale formazione del sangue. Questo test è stato creato nel 1945 da Robert Coombs, motivo per cui ha preso il nome.

Il test di Coombs è uno studio versatile che consente una diagnosi tempestiva dei disturbi emopoietici sia negli adulti che nei bambini.

Esistono i seguenti tipi di tali test:

1. Test diretto di Coombs- consente di determinare gli anticorpi situati sulla superficie dei globuli rossi. In genere, tale studio è prescritto per sospetta emolisi, anemia emolitica autoimmune e altre malattie autoimmuni. Inoltre, viene effettuato dopo terapia farmacologica con farmaci a base di chinino, penicillina o metildopa, oppure dopo una trasfusione di sangue. Per ottenere risultati più accurati, prima dello studio, è necessario interrompere completamente l'assunzione di farmaci con almeno 1 settimana di anticipo.
2. Test di Coombs indiretto- un test in grado di rilevare gli anticorpi anti-eritrociti nel plasma. Di solito viene eseguito durante la gravidanza e prima di una trasfusione di sangue. Gli anticorpi anti-eritrociti compaiono nel sangue umano durante l'immunità reattiva o come reazione a determinati farmaci. Per uno studio più accurato, vengono eseguiti più campionamenti contemporaneamente con un intervallo di 2 ore.

Indizi per realizzazione

Il test di Coombs viene eseguito solo in presenza di gravi indicazioni. Questo è uno studio costoso e lungo, che è un test specifico.

Tipicamente, le seguenti situazioni sono considerate indicazioni per la sua attuazione:

1. Durante la trasfusione di sangue. Il test consente di determinare se il sangue del ricevente attecchirà nel corpo umano e se la donazione è possibile. In questo caso, è necessario esaminare il materiale sia del donatore che del ricevente. È importante determinare la natura degli anticorpi, perché se sono incompatibili nel corpo sullo sfondo del conflitto Rhesus, il sistema immunitario viene distrutto. Ciò porta allo sviluppo di gravi malattie e in rari casi persino alla morte.
2. Prima dell'intervento chirurgico, quando c'è il rischio di perdita di sangue. Questo viene fatto in modo che il medico possa immediatamente iniettare sangue adatto per ripristinare il corpo.
3. Per rilevare la sensibilizzazione Rh. Rhesus è un antigene specifico che si verifica nel corpo di ogni donna durante la gravidanza. Se la madre ha un Rh positivo, e il padre è negativo, o viceversa, non c'è dipendenza per il bambino, può ereditare chiunque. Se il bambino riceve l'Rh materno opposto, il rischio di sensibilizzazione è alto. Questo fenomeno è caratterizzato dalla mescolanza del sangue della madre e del bambino. Questo può accadere sia durante la gestazione che durante il parto.

Se si verifica un conflitto Rhesus nel corpo di una donna incinta, l'immunità della madre inizia a percepire il suo feto come un corpo estraneo. Per questo motivo, c'è un alto rischio che inizi ad attaccarlo.

Come risultato di tali azioni, il bambino può sviluppare gravi patologie. Molto spesso si verifica l'eritroblastosi, un fenomeno in cui il corpo del bambino non può produrre un numero sufficiente di globuli rossi.

Inoltre, a causa del conflitto Rh, può verificarsi la morte del feto nell'utero o immediatamente dopo la nascita. Con il giusto approccio al trattamento, tali gravi conseguenze possono essere facilmente evitate.

Deviazioni dalla norma

Con un risultato positivo per la reazione di Coombs, il medico conclude che ci sono anticorpi contro i globuli rossi nel siero del sangue. Ciò suggerisce che il sangue del donatore potrebbe non essere compatibile con il sangue del paziente.

Se viene diagnosticato un risultato positivo nel corpo di una donna incinta con sangue Rh negativo, il suo corpo contiene anticorpi contro il sangue del feto.

Ciò indica un conflitto Rh, che richiede un approccio estremamente attento alla gestione della gravidanza da parte del medico, nonché l'attuazione di tutte le istruzioni e raccomandazioni da parte della donna.

Se gli anticorpi sono presenti nel sangue del bambino, viene diagnosticata la malattia emolitica del neonato. In questo caso viene effettuato un secondo studio per determinare se vi sia o meno un aumento della cetra di anticorpi nel sangue della futura mamma.

Possibili complicazioni del test di Coombs

Il test di Coombs è uno studio abbastanza sicuro che consente di diagnosticare una serie di malattie autoimmuni nelle fasi iniziali. Raramente causa complicazioni, di solito le conseguenze negative sono associate al prelievo di sangue.

Consistono in:

• Sanguinamento se emorragie sotto la pelle
• Vertigini e svenimento
• Infezione infettiva

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Normalmente, non ci sono anticorpi contro gli eritrociti nel sangue.

Il test diretto di Coombs è un test dell'antiglobulina (agglutinazione su gel, che consente la rilevazione di anticorpi bivalenti completi), che determina gli anticorpi della classe IgG e la componente C3 del complemento sulla superficie degli eritrociti. Tipicamente, gli anticorpi rilevati dal test di Coombs diretto hanno un'ampia specificità non associata a un antigene ben consolidato. Un test di Coombs diretto positivo indica chiaramente la presenza di anemia emolitica in un paziente, sebbene non tutti i pazienti con un test antiglobulinico diretto positivo abbiano questa malattia. Circa il 10% dei pazienti con anticorpi o componenti del complemento sulla membrana eritrocitaria non può essere rilevato da un test di Coombs diretto (test negativo), ma soffre comunque di anemia emolitica autoimmune. Per chiarire la specificità degli anticorpi in tali casi, vengono utilizzati i test con la loro eluizione. Il test diretto di Coombs, positivo solo per il complemento, è solitamente associato ad anticorpi IgM di tipo freddo. In questo caso, gli anticorpi IgM non sono presenti sugli eritrociti alla temperatura corporea basale. Tuttavia, poiché gli anticorpi IgM fissano attivamente il complemento e il complemento rimane sugli eritrociti, in questa forma di anemia emolitica autoimmune (malattia da agglutinine fredde), il test di Coombs sarà positivo solo per il complemento.

Il test di Coombs diretto è positivo nell'anemia emolitica autoimmune causata da anticorpi caldi, nell'anemia autoimmune da farmaci (durante l'assunzione di metildopa, fino al 20% dei pazienti ha una reazione positiva), nel tipo di anemia emolitica da assorbimento di farmaci, nel tipo di anemia emolitica immunocomplessa (il test è positivo solo per C3), con anemia emolitica autoimmune causata da anticorpi freddi - malattia da agglutinine fredde (il test è positivo solo per C3). Con l'emoglobinuria parossistica da freddo, il test diretto di Coombs è negativo.

Test di Coombs indiretto: un test dell'antiglobulina indiretto (rileva anticorpi incompleti) consente di rilevare anticorpi atipici nel sangue, inclusi alloanticorpi, contro antigeni eritrocitari estranei. Ha preso il nome (indiretto) dal fatto che procede in 2 fasi. Inizialmente, il siero del sangue del paziente, contenente anticorpi incompleti, interagisce con l'Ag diagnosticum corpuscolare aggiunto senza manifestazioni visibili. Nella seconda fase, il siero antiglobulinico introdotto interagisce con anticorpi incompleti adsorbiti sugli antigeni, con la comparsa di un precipitato visibile. La trasfusione di globuli rossi omologhi (allogenici) o la gravidanza sono le cause più comuni di questi anticorpi anti-globuli rossi. La combinazione di un test di Coombs indiretto positivo con un test diretto negativo non fa nulla per diagnosticare l'anemia emolitica autoimmune. Un test di Coombs indiretto positivo causa alcune difficoltà nella selezione del sangue per la trasfusione e nel confronto incrociato con il sangue conservato in banca, ma non ha altro valore diagnostico.

Test dell'antiglobulina o reazione di Coombs effettuato per identificare determinati anticorpi che attaccano i globuli rossi (eritrociti).

Gli anticorpi sono proteine ​​prodotte dal sistema immunitario. In genere, gli anticorpi si legano a sostanze estranee come batteri e virus e le distruggono.

2. Perché ho bisogno di un test anticorpale?

Un test anticorpale può essere eseguito nei seguenti casi:

Prima della trasfusione di sangue

Probabilmente sai che una persona può avere uno dei quattro gruppi sanguigni. E si può fare un test dell'antiglobulina per determinare se è possibile una trasfusione di sangue. Se stai ricevendo una trasfusione, il sangue del donatore deve corrispondere al tuo tipo (avere gli stessi antigeni). Se gli antigeni differiscono durante la trasfusione, il sistema immunitario distruggerà le cellule trasfuse. Questo può portare a gravi malattie e persino alla morte. Ecco perché trovare il giusto gruppo sanguigno è così importante.

Identificare il rischio di sensibilizzazione Rh

Rh è un antigene. Il suo nome completo è il fattore Rh. Il test di Coombs viene utilizzato per rilevare gli anticorpi contro il fattore Rh nel sangue delle donne in gravidanza. Se una donna Rh-negativa è incinta di un bambino Rh-positivo (che può essere trasmesso dal padre), c'è il rischio di sensibilizzazione Rh. La sensibilizzazione Rh si verifica quando il sangue del bambino si mescola con il sangue della madre durante la gravidanza o il parto. Se il gruppo sanguigno della madre è incompatibile con il gruppo sanguigno del bambino, il suo sistema immunitario può attaccare il feto, percependolo come un oggetto estraneo. In questo caso, può svilupparsi una grave malattia chiamata eritroblastosi fetale. In rari casi, se la malattia non viene curata, il feto o il neonato possono morire.

A una donna Rh-negativa può essere somministrata un'iniezione di una gammaglobulina anti-Rh (p. es., RhoGAM), che viene utilizzata per prevenire la malattia emolitica Rh.

Per la diagnosi di anemia emolitica autoimmune

L'anemia emolitica autoimmune è una malattia rara associata alla formazione di anticorpi contro gli autoantigeni degli eritrociti.

3. Tipi di test dell'antiglobulina

Esistono due tipi di test dell'antiglobulina, o test di Coombs: diretto e indiretto.

Test diretto di Coombs o test diretto dell'antiglobulina rileva gli anticorpi associati ai globuli rossi. È usato per determinare l'anemia. In questa malattia, i globuli rossi vengono distrutti più velocemente di quanto non vengano prodotti.

Test indiretto di Coombs o test indiretto dell'antiglobulina eseguita per la ricerca di anticorpi non associati ai globuli rossi. Per il campione viene utilizzato il siero del sangue, in cui si trovano gli anticorpi. Questa procedura è piuttosto rara: viene eseguita principalmente per determinare la possibilità di una trasfusione di sangue o come fase nell'esame delle donne in gravidanza.

4. Risultati della reazione di Coombs

Norma:

Risultato negativo del test - nessun anticorpo rilevato.

• Test diretto di Coombs. Un risultato negativo del test dell'antiglobulina diretta significa che il sangue non ha anticorpi associati ai globuli rossi.
• Test di Coombs indiretto. Un risultato negativo del test antiglobulina indiretto significa che il tuo sangue è compatibile con il sangue del donatore. Per una donna incinta, questo risultato significa che il suo corpo non ha sviluppato anticorpi contro il gruppo sanguigno Rh-positivo del suo bambino (non si è verificata sensibilizzazione Rh).

Deviazione dalla norma:

• Test diretto di Coombs. Un test antiglobulina diretto positivo significa che il tuo sangue ha anticorpi che combattono contro i globuli rossi. Ciò può essere causato da trasfusioni di sangue incompatibili o malattie come l'anemia emolitica o la malattia emolitica del neonato (HDN).
• Test di Coombs indiretto. Un risultato positivo del test dell'antiglobulina indiretta significa che il tuo sangue non è compatibile con il sangue del donatore. In una donna incinta, tali risultati indicano la presenza di anticorpi contro il fattore Rh positivo del sangue del bambino (sensibilizzazione Rh). Se il bambino ha un fattore sanguigno Rh positivo, la madre sarà attentamente monitorata da un medico per tutta la gravidanza.

Anticorpi situato sulla superficie degli eritrociti, può essere sia in uno stato statico che libero in plasma del sangue. A seconda dello stato degli anticorpi, viene eseguita una reazione di Coombs diretta o indiretta. Se c'è motivo di credere che gli anticorpi siano fissati sulla superficie dei globuli rossi, viene eseguito un test di Coombs diretto. In questo caso, il test passa in una fase - viene aggiunto siero antiglobulinico. Se sulla superficie dei globuli rossi sono presenti anticorpi incompleti, agglutinazione eritrociti.

Reazione indiretta

La reazione indiretta di Coombs procede in 2 fasi. Innanzitutto, è necessario implementare artificialmente sensibilizzazione eritrociti. Per fare ciò, vengono incubati gli eritrociti e il siero del sangue in esame, il che provoca la fissazione degli anticorpi sulla superficie degli eritrociti. Successivamente, viene eseguita la seconda fase del test di Coombs: l'aggiunta di siero antiglobulina.

reazione di precipitazione - RP (dal lat praecipilo precipitare) è la formazione e la precipitazione di un complesso di un antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di torbidità, chiamato precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti, un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario. La reazione di precipitazione viene messa in provette (reazione di precipitazione dell'anello), in gel, mezzi nutritivi, ecc. Le varietà della reazione di precipitazione in un gel semiliquido di agar o agarosio sono ampiamente utilizzate, doppia immunodiffusione secondo Ouchterlony, immunodiffusione del radio, immunoelettroforesi e così via.

Tipizzazione HLA- studio del principale complesso di istocompatibilità umana - complesso HLA. Questa formazione include una regione di geni sul cromosoma 6 che codifica per gli antigeni HLA coinvolti in varie risposte immunitarie.

Compiti a Tipizzazione HLA può essere molto diverso - identificazione biologica (il tipo HLA è ereditato insieme ai geni dei genitori), determinazione della predisposizione a varie malattie, selezione dei donatori per il trapianto di organi - in questo caso vengono confrontati i risultati della tipizzazione HLA dei tessuti del donatore e del ricevente. Con l'aiuto della tipizzazione HLA, si determina quanto i coniugi siano simili o diversi in termini di antigeni di compatibilità tissutale al fine di diagnosticare casi di infertilità.

La tipizzazione HLA suggerisce Analisi del polimorfismo HLA ed è effettuato con due metodi: sierologico e genetico molecolare. Il metodo sierologico classico di tipizzazione HLA si basa sul test microlinfocitotossico, mentre il metodo molecolare utilizza la PCR (reazione a catena della polimerasi).

sierologico Tipizzazione HLA eseguita su popolazioni cellulari isolate. Gli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità sono trasportati principalmente dai linfociti. Pertanto, una sospensione di linfociti T viene utilizzata come principale vettore di antigeni di classe I e una sospensione di linfociti B per la determinazione degli antigeni HLA di classe II. La centrifugazione o la separazione immunomagnetica viene utilizzata per isolare le popolazioni cellulari desiderate dal sangue intero. Si ritiene che il primo metodo possa portare a dati falsi positivi, poiché in questo caso alcune cellule muoiono. Il secondo metodo è riconosciuto come più specifico, mentre oltre il 95% delle cellule rimane vitale.

Ma la base per mettere in scena un test linfocitotossico Tipizzazione HLAè un siero specifico contenente anticorpi contro varie varianti alleliche degli antigeni HLA di classe I e II. Il test sierologico consente di determinare il tipo di HLA esaminando quali dei sieri reagiscono con i linfociti e quali no.

Se si verifica una reazione tra cellule e siero, sulla superficie della cellula si forma un complesso antigene-anticorpo. Dopo l'aggiunta di una soluzione contenente complemento, si verificano lisi e morte cellulare. Il test sierologico della tipizzazione HLA viene valutato utilizzando la microscopia a fluorescenza per valutare le reazioni positive (fluorescenza rossa) e negative (fluorescenza verde), o la microscopia a contrasto di fase per colorare i nuclei delle cellule morte. Il risultato della tipizzazione HLA viene derivato tenendo conto della specificità dei sieri reagiti e dei gruppi di antigeni a reazione incrociata, dell'intensità della reazione di citotossicità.

Gli svantaggi del sierologico Tipizzazione HLA sono la presenza di reazioni incrociate, debole affinità anticorpale o bassa espressione di antigeni HLA, assenza di prodotti proteici in un certo numero di geni HLA.

Metodi molecolari più moderni Tipizzazione HLA vengono utilizzati campioni sintetici già standardizzati, che non reagiscono con gli antigeni sulla superficie dei leucociti, ma con il DNA e indicano direttamente quali antigeni sono presenti nel campione. I metodi molecolari non richiedono leucociti vivi, qualsiasi cellula umana può essere studiata e pochi microlitri di sangue sono sufficienti per funzionare, oppure può essere limitato al raschiamento della mucosa orale.

Genetica molecolare Tipizzazione HLA utilizza il metodo PCR, il cui primo passo è ottenere DNA genomico puro (da sangue intero, sospensione di leucociti, tessuti).

Quindi il campione di DNA viene copiato - amplificato in una provetta utilizzando primer (DNA a filamento singolo corto) specifici per uno specifico locus HLA. Le estremità di ciascuna coppia di primer devono essere strettamente complementari a una sequenza univoca corrispondente a un particolare allele, altrimenti non si verifica alcuna amplificazione.

Dopo la PCR, durante la copia ripetuta, si ottiene un gran numero di frammenti di DNA, che possono essere valutati visivamente. Per fare ciò, le miscele di reazione vengono sottoposte a elettrolisi o ibridazione e viene determinato se si è verificata un'amplificazione specifica utilizzando un programma o una tabella. Il risultato della tipizzazione HLA è presentato sotto forma di un rapporto completo a livello genico e allelico. A causa della standardizzazione dei campioni utilizzati, il molecolare Tipizzazione HLA più precisamente sierologico. Inoltre, fornisce maggiori informazioni (più nuovi alleli del DNA) e un livello di dettaglio più elevato, poiché consente di identificare non solo gli antigeni, ma anche gli alleli stessi, che determinano quale antigene è presente sulla cellula.

reazione di lisi immunitaria. La reazione si basa sulla capacità di anticorpi specifici di formare immunocomplessi con cellule, inclusi eritrociti, batteri, che porta all'attivazione del sistema del complemento lungo la via classica e la lisi cellulare. Delle reazioni di lisi immunitaria, la reazione di emolisi è più spesso utilizzata e raramente la reazione di batteriolisi (principalmente nella differenziazione del colera e dei vibrioni simili al colera).

reazione di emolisi. Sotto l'influenza della reazione con gli anticorpi in presenza del complemento, la sospensione torbida degli eritrociti si trasforma in un liquido trasparente rosso vivo - "sangue laccato" a causa del rilascio di emoglobina. Quando si imposta una reazione diagnostica di fissazione del complemento (RCC), la reazione di emolisi viene utilizzata come indicatore: per testare la presenza o l'assenza (legame) del complemento libero.

Reazione di emolisi locale in gel(Reazione di Jerne) è una delle varianti della reazione di emolisi. Ti consente di determinare il numero di cellule che formano anticorpi. Il numero di cellule che secernono anticorpi - emolisine, è determinato dal numero di placche di emolisi che compaiono in un gel di agar contenente eritrociti, una sospensione cellulare del tessuto linfoide studiato e del complemento.

Metodo di immunofluorescenza

(RIF, reazione di immunofluorescenza) - un metodo per rilevare Ag (Ab) specifico utilizzando Ab (Ag) coniugato con fluorocromo. Ha un'elevata sensibilità e specificità. È usato per le infezioni espresse da d-ki. malattie (identificazione dell'agente eziologico nel materiale di ricerca), nonché per la determinazione di anticorpi e recettori di superficie e marcatori di leucociti (immunofenotipizzazione) e altre cellule. I.m. diretto consiste nella lavorazione di una sezione o striscio di tessuto da materiale patologico o microbico to-ry with-coy contenente anticorpi specifici coniugati con fluorocromo; il farmaco viene lavato per rimuovere gli anticorpi non legati ed esaminato al microscopio a fluorescenza. In casi positivi, un complesso immunitario luminoso appare attorno alla periferia dell'oggetto. Il controllo è necessario per escludere la luminescenza non specifica. A indiretto. Loro. nella prima fase, una sezione o striscio di tessuto viene trattata con un agente specifico non fluorescente, nella seconda fase, con un agente luminescente contro le -globuline di quell'animale, che è stato applicato nella prima fase. In caso positivo si forma un complesso luminoso costituito da Ar, Am ad esso e Am contro At (metodo sandwich). Oltre a un microscopio luminescente, per tenere conto della RIF durante la fenotipizzazione cellulare, selezionatore di cellule laser .

citometria a flusso- un metodo di misurazione ottica dei parametri di una cellula, dei suoi organelli e dei processi che si verificano in essa.

La tecnica consiste nel rilevare la diffusione della luce da un raggio laser quando una cellula lo attraversa in un getto liquido, e il grado di dispersione della luce permette di avere un'idea delle dimensioni e della struttura della cellula. Inoltre, l'analisi tiene conto del livello di fluorescenza dei composti chimici che compongono la cellula (autofluorescenza) o introdotti nel campione prima della citometria a flusso.

La sospensione cellulare, precedentemente marcata con anticorpi monoclonali fluorescenti o coloranti fluorescenti, entra nel flusso liquido che passa attraverso la cella a flusso. Le condizioni sono selezionate in modo tale che le celle si allineino una dopo l'altra a causa del cosiddetto. focalizzazione idrodinamica di un getto in un getto. Nel momento in cui la cellula attraversa il raggio laser, i rivelatori registrano:

light scattering a piccoli angoli (da 1° a 10°) (questa caratteristica serve a determinare la dimensione delle celle).

diffusione della luce con un angolo di 90° (consente di giudicare il rapporto nucleo/citoplasma, nonché l'eterogeneità e la granularità delle cellule).

intensità di fluorescenza in diversi canali di fluorescenza (da 2 a 18-20) - consente di determinare la composizione della sottopopolazione della sospensione cellulare, ecc.