Diagnosi batteriologica delle malattie infettive. Vantaggi del metodo batteriologico per la diagnosi delle malattie infettive. Il metodo di ricerca batteriologico include

Metodo di ricerca batteriologica. Isolamento di una coltura pura di batteri aerobi (1-2 stadi)

1. L'essenza del metodo batteriologico

3. Metodi per ottenere colonie isolate

4. Metodi per ottenere la coltura pura

1. Eseguire la semina primaria con il metodo Koch e Drygalski

2. Isolare la coltura pura

Piano di lavoro:

1. Metodo di ricerca batteriologico

2. Fasi del metodo batteriologico

3. Concetto: coltura pura, ceppo, colonia

4. Metodi per ottenere colonie isolate

5. Metodi per ottenere una coltura pura di batteri aerobi

Il metodo principale di diagnosi di laboratorio delle malattie infettive è il metodo batteriologico. L'essenza del metodo batteriologico è l'isolamento dei patogeni dal materiale in esame e la sua identificazione (definizione del genere, specie, varietà).

Il metodo batteriologico consente di determinare:

1. Tipo di agente patogeno e diagnosi della malattia

2. Antibiotici che uccidono l'agente patogeno e prescrivono il trattamento appropriato

3. Fagovari e sierotipi dell'agente patogeno per identificare la fonte dell'infezione

La prima fase è l'inoculazione primaria del materiale di prova per ottenere colonie isolate. La semina primaria viene effettuata su supporti di accumulo e DDS (supporti a tazza).

La seconda fase è la caratterizzazione delle colonie isolate e l'ottenimento di una coltura pura da esse riseminando su una colonna inclinata del terreno principale.

La terza fase è l'identificazione di una cultura pura: la determinazione del genere, della specie, delle varietà dell'agente patogeno, la determinazione della sensibilità agli antibiotici, la determinazione dei fagovar.

La coltura di microrganismi è costituita da batteri cresciuti su terreni nutritivi. Una coltura pura è una specie di batteri cresciuti su terreni nutritivi. All'interno di una specie, ci sono varietà che differiscono in un tratto:

1. Morphovars - differiscono nella morfologia

2. Chemovars - differiscono nelle proprietà biochimiche

3. Serovars - differiscono nelle proprietà antigeniche

4. Fagovars - differiscono nella sensibilità ai fagi

Una coltura pura è necessaria per l'identificazione, la determinazione di serovars, fagovars, sensibilità agli antibiotici. Un ceppo è una specie di batterio isolato da una fonte specifica (fiume Volga, Ivanov malato, ecc.). colonia - un accumulo visibile di batteri della stessa specie, formato durante la riproduzione di una cellula batterica su un denso mezzo nutritivo.

La prima fase dello studio è l'inoculazione primaria del materiale di prova per ottenere colonie isolate. Prima dell'inoculazione iniziale, viene eseguita la microscopia del materiale di prova. Il materiale di prova di solito contiene una miscela di vari batteri, inclusi agenti patogeni. Per isolare l'agente patogeno è necessario ottenere colonie isolate (batteri della stessa specie) selezionando un mezzo nutritivo e utilizzando speciali metodi di semina.

Esistono due metodi per ottenere colonie isolate:

1. Metodo Drygalski

L'essenza del metodo batterioscopico: rilevamento di microbi nel materiale di prova; lo studio delle loro proprietà morfologiche e tintoriali, la natura della posizione nello striscio batteriologico nel campo visivo.

Tecnica di esecuzione. Il materiale del paziente viene studiato visivamente, viene selezionata una porzione in cui l'agente eziologico della malattia (grumi di muco, tappi purulenti) può essere rilevato con il massimo grado di probabilità. Viene applicato su un vetrino (a volte il materiale è pre-emulsionato in soluzione salina, meno spesso centrifugato). La goccia viene stesa sul vetro, asciugata e fissata. Successivamente, lo striscio viene colorato e la preparazione viene osservata al microscopio. Lo striscio è solitamente colorato con Gram. A volte, come il più delicato, viene utilizzato uno dei semplici metodi di colorazione, quindi la preparazione viene dipinta con un colorante (ad esempio, nella diagnosi di infezione meningococcica, colera).

Se necessario, vengono utilizzati speciali metodi di colorazione sofisticati, come il metodo Burri-Gins per il rilevamento di organismi capsulari o il metodo Ziehl-Neelsen per il rilevamento di batteri acido-resistenti. In alcuni casi (in particolare, quando si studia l'attività motoria dei microrganismi), vengono preparati preparati a "goccia sospesa" e "goccia schiacciata" e vengono microscopiati batteri non colorati.

Vantaggi del metodo batterioscopico: facilità di esecuzione, capacità di ottenere rapidamente risultati, accessibilità tecnica ed economica.

Svantaggi del metodo: per determinare il tipo di microrganismi, spesso non è sufficiente determinarne le proprietà morfologiche, poiché sono identiche nei rappresentanti di specie affini. Inoltre, batteri con morfologia caratteristica subiscono spesso alterazioni, soprattutto sotto l'azione di antibiotici, e diventano irriconoscibili; infine, la concentrazione di agenti patogeni nel materiale di prova può essere estremamente bassa, e quindi è difficile rilevarli.

In considerazione di quanto sopra, il metodo batterioscopico è usato raramente come unico e ultimo modo per stabilire l'eziologia della malattia. Più spesso viene utilizzato come indicativo, preliminare e nella diagnosi di alcune malattie infettive non viene fornito affatto.

Come capire orientamento e preliminare? Questo vale per il clinico e il batteriologo. Il clinico, ricevendo una risposta preliminare (positiva o negativa), utilizza in misura maggiore o minore le informazioni ricevute nei suoi ulteriori studi fino ad ottenere il risultato finale del metodo diagnostico batteriologico. Il batteriologo, dopo aver ricevuto informazioni indicative sul sospetto patogeno, la sua concentrazione nel materiale utilizzato, la presenza di microflora concomitante, determina i metodi di lavorazione del materiale e l'isolamento della coltura pura del patogeno, seleziona i terreni nutritivi per la successiva coltivazione.

Metodo batteriologico

L'essenza del metodo è l'isolamento di una coltura pura del microbo - patogeno da materiale patologico, uno studio dettagliato delle sue proprietà morfologiche, tintoriali, culturali, biochimiche, sierologiche con l'obiettivo della successiva identificazione dell'agente patogeno. Quando si implementa il metodo batteriologico di ricerca, si distinguono 4 fasi.

A. Tenendo conto dei dati ottenuti durante l'esame batterioscopico, vengono selezionati i terreni nutritivi più efficaci, sui quali, con il maggior grado di probabilità, sarà possibile ottenere la crescita di una coltura di presunti microbi - patogeni.

B. Il materiale di prova viene seminato su una serie di mezzi nutritivi: liquido e solido, universale, elettivo-selettivo, diagnostico differenziale. Allo stesso tempo, la semina su piastre Petri con densi terreni nutritivi viene effettuata con un ciclo batteriologico con un colpo per garantire la possibilità di ottenere la crescita di colonie microbiche isolate l'una dall'altra (è anche possibile utilizzare il metodo Drygalsky o un altro metodo di separazione delle colture di microrganismi).

A. Vengono studiate le proprietà colturali dei microrganismi cresciuti su terreni nutritivi; vengono selezionate colonie sospette. Va sottolineato che la selezione delle colonie sospette è la fase più importante e difficile del lavoro. Si basa principalmente sulla determinazione delle caratteristiche delle colonie microbiche, ma spesso ciò non consente di differenziare le colonie microbiche delle singole specie ed è necessario studiare ulteriormente la morfologia dei microbi negli strisci da colonie sospette, le caratteristiche di crescita dei microrganismi su mezzi diagnostici differenziali, ecc. L'isolamento di colture pure di batteri e il loro studio possono essere effettuati effettuando un'inoculazione preliminare su terreni di accumulo liquidi, ma in questo caso viene impiegato ulteriore tempo di ricerca.

B. Viene preparato uno striscio batteriologico da colonie sospette, colorate secondo Gram e microscopicamente (viene stabilita l'identità dei microrganismi con quelli studiati durante l'esame microscopico al 1o stadio). C. Dal resto della colonia sospetta, la coltura viene trasferita su agar beveled meat-peptone (possono essere utilizzati altri terreni nutritivi, sui quali si prevede una buona crescita dei microrganismi isolati). L'obiettivo è l'accumulo di una cultura pura del microbo - il presunto agente eziologico della malattia, perché. nella fase successiva dello studio sarà richiesta molta massa microbica.

Il patogeno proposto è studiato per le proprietà saccarolitiche (l'inoculo viene effettuato su terreni variegati, Olkenitsky, Ressel media, ecc.), l'attività proteolitica (inoculo su gelatina, latte secondo Tukaev, determinazione della formazione di indolo e idrogeno solforato durante la crescita su brodo di carne-peptone). Viene studiata la sensibilità delle colture isolate agli antibiotici (più spesso con il metodo dei dischi di carta standard, meno spesso con il metodo delle diluizioni seriali). La sierotipizzazione viene effettuata nella reazione di agglutinazione su vetro con sieri diagnostici di gruppo e tipici; tipizzazione fagica con batteriofagi diagnostici standard. In alcuni casi, i fattori di patogenicità nei batteri vengono studiati per l'identificazione.

I risultati della ricerca condotta sono presi in considerazione. Sulla base di un confronto delle proprietà identificate nei microrganismi (morfologiche, tintorie, colturali, biochimiche, sierologiche, ecc.), i microbi vengono identificati. Una risposta finale viene fornita con i risultati di uno studio batteriologico, che indica il tipo di patogeno (a volte il suo sierotipo, biovar, tipo di fago) e la sua sensibilità agli antibiotici.

Molto spesso, per ottenere risultati affidabili, l'emissione di una risposta è preceduta da metodi di ricerca biologici, allergologici o di altro tipo.

Vantaggi del metodo diagnostico batteriologico: elevata affidabilità dei risultati della ricerca; la possibilità di ottenere ulteriori dati sulla sensibilità degli agenti patogeni isolati agli antibiotici; la possibilità di condurre studi epidemiologici.

Agli svantaggi del metodo può includere la durata dello studio (almeno 4-5 giorni), nonché l'impossibilità di utilizzarlo nei casi in cui le infezioni da agenti patogeni (ad esempio rickettsia, clamidia) non crescono su terreni nutritivi artificiali.

metodo biologico

In alcuni casi, per ottimizzare la diagnosi delle malattie infettive, viene utilizzato un metodo biologico (biosaggio) che prevede l'infezione di animali da laboratorio. In questo caso, il ricercatore può avere diversi obiettivi:

Riproduzione del quadro clinico e patoanatomico della malattia (ad esempio, nella diagnosi di tetano, leptospirosi);

Isolamento in breve tempo di una coltura pura del patogeno (nella diagnosi di infezione pneumococcica);

Determinazione della virulenza e patogenicità dell'agente patogeno (nella diagnosi della tubercolosi);

Determinazione del tipo e del tipo di tossine (nella diagnosi del botulismo)

Vari animali sono usati per diagnosticare malattie infettive. La loro scelta è determinata dalla suscettibilità delle specie a vari agenti eziologici. Ad esempio, i topi sono suscettibili all'infezione da pneumococco, antrace, tetano; porcellini d'India - a patogeni di tubercolosi, brucellosi, tularemia; conigli - a stafilococchi, streptococchi, botulismo. Per lo studio vengono selezionati solo animali sani di una certa età e peso corporeo.

Prima dell'introduzione del materiale, gli animali vengono riparati. I piccoli animali sono tenuti dallo sperimentatore, per i grandi animali vengono utilizzati dispositivi speciali. Il sito di iniezione del materiale infetto viene trattato con alcool o iodio. Il materiale infetto viene somministrato per via sottocutanea, cutanea, endovenosa, intraperitoneale, intracerebrale, ecc., a seconda delle caratteristiche della patogenesi della malattia in esame.

A metodo della pelle le infezioni pretagliano la lana, scarificano la pelle e poi strofinano il materiale su di essa.

Metodo sottocutaneo: la pelle degli animali viene catturata in una piega, preferibilmente con una pinzetta, l'ago viene inserito a metà, dopo l'iniezione viene applicato un batuffolo di cotone con alcool e l'ago viene rimosso.

Metodo intramuscolare: il materiale viene iniettato nel tessuto muscolare della parte superiore dell'arto posteriore.

Metodo intraperitoneale: l'animale viene tenuto sottosopra per non ferire l'intestino. L'iniezione viene effettuata nell'addome inferiore, sul lato della linea mediana. La parete addominale è perforata con un movimento a scatti, la siringa è ad angolo retto.

Metodo endovenoso: topi, ratti vengono iniettati con materiale - nella vena della coda o intracardiaco. Il coniglio viene iniettato - nelle vene dell'orecchio, che sono localizzate superficialmente e chiaramente visibili (è meglio perforare la vena esterna). Il sito di iniezione dopo l'iniezione viene bloccato con un batuffolo di cotone con alcool in modo che non vi sia sanguinamento. Le cavie con infezione intracardiaca vengono iniettate con un ago all'altezza dello "shock" del cuore nello spazio intercostale. Se l'ago è inserito correttamente, il sangue apparirà nella siringa.

Preparazione di strumenti e materiali: siringhe, bisturi, aghi vengono sterilizzati mediante bollitura. Il materiale viene aspirato nella siringa (un po' più del necessario per entrare), ruotato verticalmente verso l'alto, coprire l'ago con un batuffolo di cotone sterile e spingere le bolle d'aria fuori dalla siringa con un pistone. Questa manipolazione viene eseguita su una soluzione disinfettante.

Quando si diagnosticano infezioni causate dall'azione di una tossina (botulino, antrace), il materiale, presumibilmente contenente l'agente patogeno e le tossine, viene posto in soluzione fisiologica, quindi filtrato attraverso un filtro di carta strofinato con talco (assorbe bene la tossina). Gli animali sensibili vengono infettati con i tamponi filtranti. In alcuni casi, quando la patogenesi della malattia è dovuta alle proprietà patogene del patogeno stesso, gli animali vengono infettati da una sospensione microbica.

I topi bianchi infetti vengono etichettati e posti in appositi barattoli di vetro; sono apposti con un cartellino indicante la data di infezione e il tipo di microrganismo con cui è stato effettuato il lavoro. Allo stesso modo vengono firmate le gabbie con conigli o cavie infetti. Gli animali vengono sorvegliati. In caso di morte, vengono immediatamente aperti.

Prima della dissezione dei topi bianchi, gli animali vengono preliminarmente soppressi con vapori di etere. I topi vengono brevemente immersi in una soluzione disinfettante e poi fissati in una cuvetta con l'addome sollevato dalle zampe. Si nota la presenza o l'assenza di alterazioni patologiche esterne. L'incisione cutanea viene praticata longitudinalmente dal pube alla mascella inferiore e trasversalmente verso le estremità. Si notano cambiamenti nel tessuto cutaneo e nello stato dei linfonodi. Da quest'ultimo fanno impronte di sbavature. Per esaminare la cavità toracica, lo sterno viene rimosso incidendo le costole su entrambi i lati con le forbici. Dopo un esame esterno, i pezzi del cuore vengono tagliati e posti nel BCH. La semina viene effettuata direttamente sulle impronte di strisci MPA dal cuore, dai polmoni.

La cavità addominale viene aperta, durante un esame esterno si nota lo stato degli organi interni (dimensione, colore, consistenza, presenza di focolai purulenti). Fai raccolti di fegato, milza e impronte di sbavature.

Il lavoro viene svolto con strumenti sterili, dopo ogni presa dell'organo, pinzette e forbici vengono abbassate in un bicchiere di alcool e bruciate.

Dopo l'autopsia, il cadavere e la cuvetta dove è stata eseguita l'autopsia vengono cosparsi di disinfettante per un giorno.

Le colture vengono incubate per 24 ore (o più se necessario) a

t 37 circa C. Quindi vengono esaminati, viene isolata una coltura pura dell'agente patogeno e la sua identificazione viene effettuata utilizzando il metodo batteriologico.

Vantaggi del metodo: affidabilità dei risultati ottenuti, nessuna necessità di attrezzature complesse.

Screpolatura: costo elevato, uso limitato, rischio di infezione.

Informazioni simili.

1. Campionamento materiale. La natura del materiale dipende dalla localizzazione primaria o secondaria del microbo patogeno. Se il materiale è costituito da feci, cosa che accade più spesso, vengono assunte prima o dopo un'interruzione giornaliera della terapia antibiotica. È meglio prelevare il materiale con un tubo rettale, un tampone da pannolino sterile o carta pergamena sterile, un apposito dispositivo per la raccolta delle feci (in nessun caso deve entrare in contatto con disinfettanti). Se il materiale è sangue, vengono prelevati 10,0 ml di sangue dalla vena della curva del gomito.

2. Il trasporto del materiale è effettuato da un operatore sanitario nel sistema "vetro, metallo" entro non più di tre ore dalla sua raccolta o in un conservatore con documenti di accompagnamento.

3. I terreni nutritivi utilizzati per la ricerca batteriologica possono essere suddivisi in tre gruppi:

A. Mezzi di arricchimento che creano le condizioni per la riproduzione predominante dell'agente patogeno isolato e si basano sul principio della presenza nell'ambiente di fattori di attivazione della crescita di questo microbo o sul principio della soppressione della crescita dei microbi antagonisti che lo accompagnano. Il primo gruppo corrisponde al mezzo Rapoport, il secondo - selenite, magnesio, Muller, con penicillina, ecc.;

B. Terreni diagnostici differenziali - terreni nutritivi densi contenenti un carboidrato differenziante - lattosio e un indicatore. Escherichia coli che decompone il lattosio (lattosio-positivo) cresce sotto forma di colonie colorate, a seconda del tipo di terreno - in rosso cremisi e rosa (Endo, terreno di Ploskirev) o blu scuro (terreno di Levin). Klebsiella pneumonia decompone il lattosio in terreno con indicatore blu di bromotimolo e forma colonie gialle, mentre le colonie di biovar lattosio-negative formano colonie di colore medio. Anche Salmonella e shigella negli ambienti di Endo, Levin, Ploskirev non decompongono il lattosio e danno colonie incolori;

C. Terreni di accumulo di coltura pura. Il mezzo di Olkenitsky (agar a tre zuccheri) è più spesso usato. È costituito da una colonna, una parte smussata e comprende lattosio, glucosio e saccarosio, un indicatore, reagenti per la determinazione dell'idrogeno solforato e dell'ureasi. La semina viene effettuata con una puntura in una colonna e un colpo sulla superficie della parte smussata. Con la crescita dei microbi, il glucosio si decompone meglio nella colonna, il lattosio - sullo smusso, a seguito del quale il colore del mezzo cambia in modo differenziato. Con la formazione di gas, nel mezzo si formano bolle e lacune, con la produzione di idrogeno solforato, si osserva annerimento durante l'iniezione, con la produzione di ureasi, il colore del mezzo cambia in arancione.

4. L'identificazione delle colture isolate si basa sulla definizione di:

Ш Una caratteristica comune per la famiglia - bastoncini di grammo;

Ø La presenza di una capsula (in Klebsiella);

Ø Colori delle colonie su terreno in piastra;

Ш Motilità (Salmonella ed Escherichia sono mobili, Shigella e Klebsiella sono immobili);

Ø Proprietà biochimiche;

Ø Struttura antigenica;

Ш Sensibilità ai farmaci antibatterici;

Ш Sensibilità ai batteriofagi.

5. La struttura antigenica è determinata dalla determinazione preliminare del sierogruppo, più spesso con sieri adsorbiti da monorecettore, e poi il sierotipo anche con sieri adsorbiti.

6. Diagnosi sierologica: inizia con la raccolta dei sieri dei pazienti. Rilevano gli anticorpi nella reazione di agglutinazione, emoagglutinazione, agglutinazione al lattice o RSK. La diagnosi si basa sul rilevamento di anticorpi nel titolo diagnostico o sull'aumento del titolo anticorpale nel corso della malattia. (5)

Secondo l'autore (6), tra le infezioni intestinali acute, stanno diventando sempre più importanti le malattie causate da agenti patogeni, il cui ruolo nella patogenesi delle infezioni intestinali acute nell'uomo è stato stabilito relativamente di recente. Tra questi, la campilobatteriosi occupa un posto importante per la sua ampia prevalenza, la costante tendenza all'aumento dell'incidenza e il notevole danno socio-economico che ne deriva. Secondo l'OMS, in molti paesi esteri, la campilobatteriosi è la forma eziologica più comune nella struttura delle infezioni intestinali acute e, a seconda delle regioni, rappresenta dal 3 al 73% di tutte le infezioni intestinali acute. Su iniziativa dell'OMS, lo studio della campilobatteriosi è stato inserito nei programmi nazionali per il controllo delle malattie diarroiche in circa 100 paesi del mondo. L'incidenza media della campilobatteriosi nei paesi occidentali che dispongono di propri sistemi di biomonitoraggio è di 50-100 per 100.000 abitanti. Nei paesi in cui non esiste un monitoraggio mirato, le statistiche sull'incidenza differiscono di parecchie volte dal quadro reale.

I campilobatteri sono ampiamente distribuiti nell'ambiente, tra animali e uccelli. Fanno parte della microflora sia alloctona che autoctona. Tra i campilobatteri ci sono sia rappresentanti della normale microflora, sia specie patogene per animali e umani, che causano patologie della sfera riproduttiva e malattie diarroiche.

La campilobatteriosi è un grave problema per il servizio veterinario, in quanto questa malattia provoca notevoli danni economici al bestiame. Attualmente, la vaccinazione viene utilizzata per prevenirla nelle aree svantaggiate. Lo studio della campilobatteriosi nella Federazione Russa è stato avviato molto tardi, il che è associato a una serie di motivi: prima di tutto, le difficoltà e l'elevato costo della diagnostica di laboratorio associati alle peculiarità della coltivazione del campylobacter, nonché alla varietà di manifestazioni cliniche della malattia e la varietà delle modalità e dei fattori di trasmissione dei patogeni.

Al momento, l'infezione da campilobatteriosi, diffusa in tutto il mondo e paragonabile per frequenza alla salmonellosi, non viene quasi mai diagnosticata nei laboratori pratici della Federazione Russa. Quindi, nel 2002, in tutta la Russia sono stati registrati 461 casi di questa infezione, il tasso per 100mila abitanti era di 0,32. Per confronto, nello stesso periodo di tempo, l'incidenza della salmonellosi è stata rispettivamente di 49.480 e 34,27. Secondo la letteratura, fino al luglio 2002 non sono stati registrati casi di campilobatteriosi nella regione di Lipetsk. Tuttavia, c'erano i presupposti che indicavano la necessità di un monitoraggio microbiologico dell'agente eziologico di questa infezione: un'incidenza costantemente elevata di infezioni intestinali acute, una percentuale significativa di infezioni intestinali acute di eziologia sconosciuta, un alto livello di sviluppo dell'allevamento avicolo industriale nel regione, la disponibilità di prodotti avicoli (principale fattore di trasmissione della campilobatteriosi) per vari segmenti della popolazione .

Grazie all'introduzione della diagnostica batteriologica della campilobatteriosi nel laboratorio dell'ospedale clinico per le malattie infettive, per la prima volta nel 2002 sono stati rilevati e registrati casi di campilobatteriosi nella regione di Lipetsk.

Nel periodo dal 2002 al 2005 sono stati esaminati 11.607 pazienti di entrambi i sessi di età compresa tra 1 mese e 77 anni, ricoverati presso il Lipetsk Clinical Infectious Diseases Hospital con sintomi di infezione intestinale acuta.

Negli studi sono stati utilizzati ceppi di Campylobacter isolati dai pazienti esaminati (Tabella 2) e ceppi di controllo di C.jejuni ATCC 11322 (dischi Microtrol prodotti da Becton Dickinson, USA).

Il materiale per lo studio erano le feci native dei pazienti, meno spesso - il contenuto del retto, prelevato con l'aiuto di un'ansa rettale. In caso di impossibilità di consegna tempestiva del materiale per la ricerca al laboratorio, è stato collocato nel mezzo di trasporto Cary-Blair prodotto da CJSC NITsF, San Pietroburgo.

Come terreno per l'inoculazione primaria, abbiamo utilizzato il terreno nutritivo domestico campilobacgar prodotto dal Centro scientifico statale per la microbiologia applicata, Obolensk, con l'aggiunta di additivi aerotolleranti: solfato di ferro II e piruvato di sodio.

Per isolare i campilobatteri è stato utilizzato il metodo del filtro nucleare, che presenta numerosi vantaggi significativi rispetto all'inoculazione su terreni nutritivi selettivi. Sono stati utilizzati filtri con un diametro dei pori di 0,46 e 0,55 µm prodotti dal Joint Institute for Nuclear Research di Dubna. Il rifiuto di introdurre fattori selettivi (antibiotici) nel terreno ha contribuito a ridurre il periodo di isolamento di Campylobacter a 24 ore di incubazione (54,2% dei ceppi), la possibilità di rilevare diversi tipi di Campylobacter; crescita dell'agente patogeno in coltura pura, che semplifica notevolmente il calcolo dei risultati della semina.

Le colture sono state incubate a una temperatura di 42,0°C in condizioni microaerofile e capnofile in speciali sistemi di incubazione Genbox di bio Merieux (Francia) utilizzando pacchetti di generazione di gas Campilogaz prodotti da INKO LLC, San Pietroburgo, progettati per creare un'atmosfera artificiale priva di ossigeno e arricchito con ossigeno anidride carbonica. La composizione dell'atmosfera artificiale generata dal pacchetto "Campilogas" in un recipiente con un volume di 2,5-3 l: O2 - 5-7% vol., CO2 8-10% vol. La durata dell'incubazione è stata di 48 ore con osservazione obbligatoria delle colture dopo 24 ore.

L'identificazione primaria delle colonie sospettate di essere campylobacter è stata testata utilizzando un kit di agglutinazione al lattice Campylobacter test kit di OXOID (Gran Bretagna). La tecnica si basa sull'interazione di particelle di lattice della superficie del test sensibilizzate con anticorpi campylobacteriose di coniglio con antigeni di superficie di cellule selezionate sospettate di essere campilobacteriose.

Per l'identificazione delle specie di Campylobacter, sono stati utilizzati moderni sistemi diagnostici (strisce) api Campy di bio Merieux (Francia), che consentono una combinazione una tantum di test enzimatici e di assimilazione, nonché test per la sensibilità agli antibiotici.

La contabilizzazione e l'interpretazione dei risultati è stata effettuata visivamente dopo 24 ore di incubazione a 35-37°C, confrontandoli con la tabella di identificazione.

Ad oggi, né in Russia né all'estero esisteva un documento normativo che regoli chiaramente la procedura per determinare e registrare i risultati della sensibilità del Campylobacter ai farmaci antimicrobici. La Società francese per la microbiologia (SFM) e la Società britannica per la terapia antimicrobica (BSAC) forniscono solo raccomandazioni provvisorie, mentre è difficile correlare le MIC con i diametri delle zone rachitiche, NCCLS non fornisce raccomandazioni precise.

1. L'infezione da campilobatteriosi occupa uno dei posti principali nella struttura delle infezioni intestinali acute nella regione di Lipetsk. Il tasso di incidenza per 100.000 abitanti era di 1,46 nel 2002 e di 3,34 nel 2003. I tassi massimi di incidenza si osservano nei bambini del primo anno di vita - 147,6 per 100mila della popolazione e nei bambini di 1-2 anni - 43,05 per 100mila della popolazione. C'è una somiglianza nella distribuzione di questa nosologia con altre regioni della Federazione Russa.

2. I ceppi di Campylobacter isolati nella regione di Lipetsk hanno un alto livello di sensibilità alla maggior parte degli antibiotici testati, ad eccezione delle cefalosporine di prima generazione (cephalexin, cefazolin).

3. L'uso combinato della reazione di coagglutinazione come metodo espresso di screening del segnale e la coltivazione batteriologica del campylobacter aumenta significativamente l'efficienza della diagnosi microbiologica della campilobatteriosi. (6)

Secondo la ricerca condotta da un gruppo di autori (4,5), è emerso che l'incidenza delle infezioni intestinali acute rimane ad oggi piuttosto elevata e non tende a diminuire!!! Allo stesso tempo, in una serie di infezioni intestinali acute (shigellosi Flexner 2a, escherichiosi 0157, clostridiosi), la gravità del decorso della malattia e il numero di complicanze sono aumentati negli ultimi anni e la prognosi della malattia spesso peggiora. Sfortunatamente, la diagnosi di IAI in molti casi è tardiva e il numero di errori diagnostici, secondo la nostra clinica, ha raggiunto il 12,2-14,7% negli ultimi 20 anni e rimane stabile.

Il motivo principale degli errori diagnostici è il desiderio dei medici di eseguire una diagnostica nosologica basata sull'interpretazione eziologica delle malattie. Tuttavia, va tenuto presente che il livello attuale degli studi batteriologici, virologici e sierologici non è ottimista.

Secondo i dati ufficiali, in laboratori qualificati di ospedali per malattie infettive, un doppio isolamento di una monocoltura di batteri opportunisti dalle feci dei pazienti per la prima volta in 3 giorni di malattia riesce in media nel 50% e una volta - nel 30% di casi.

Negli studi sierologici, si deve tenere conto del fatto che l'aumento del titolo anticorpale nel siero del sangue del paziente dipende non solo dal tipo di agente patogeno, ma in misura maggiore dalla reattività dell'organismo e spesso è poco espresso o non si verifica .

Allo stesso tempo, è necessaria una diagnosi precoce delle infezioni intestinali acute al capezzale del paziente, escludendo varie malattie chirurgiche, terapeutiche o altre malattie somatiche che presentano sintomi simili. Allo stesso tempo, l'interpretazione eziologica dell'AII non è necessaria, poiché la terapia etiotropica (antibatterica) per la stragrande maggioranza di queste malattie (ad eccezione della shigellosi) non viene eseguita o è di natura ausiliaria.

L'interpretazione eziologica è determinata principalmente dalla necessità di misure antiepidemiche e viene effettuata in tre situazioni:

Ø se si sospetta il colera;

Ш a focolai di gruppo di OKI;

SH con infezione nosocomiale.

In questi casi è necessario condurre approfonditi studi epidemiologici, batteriologici e sierologici. Sfortunatamente, gli studi strumentali (sigmoidoscopia, colonscopia, irrigoscopia) non sono molto istruttivi per la diagnosi urgente di infezioni intestinali acute.

La diagnosi precoce delle infezioni intestinali acute dovrebbe essere di natura sindromica al fine di identificare i sintomi caratteristici delle sindromi da intossicazione e disidratazione. Solo in questo modo è possibile garantire: una diminuzione del numero di errori diagnostici e un'attuazione tempestiva e adeguata della terapia patogenetica di emergenza. Negli ultimi 20 anni, la mortalità per AEI non è diminuita. Ci sono diverse ragioni per questo:

v un elevato numero di errori diagnostici (12,2-14,7%);

v cambiamento della composizione sociale dei pazienti (tra i deceduti, il 60% soffriva di alcolismo cronico, più di un terzo delle persone non era socialmente protetto);

v modifica del sierotipo Shigella circolante (Flexner 2a);

v Patomorfosi AII: aumento del numero di casi con danno intestinale profondo e sviluppo di peritonite. Nella nostra clinica, il tasso di mortalità per intossicazione alimentare e salmonellosi è dello 0,1% e per la shigellosi dell'1,4%.

Per ridurre la mortalità in AII, sono necessari:

v ricovero precoce in ospedali infettivi di pazienti gravi e moderati, nonché persone socialmente instabili con qualsiasi gravità della malattia;

v adeguata terapia reidratante;

v terapia etiotropica razionale della shigellosi con cefalosporine e fluorochinoloni di II-III generazione, soprattutto nei casi gravi della malattia;

v diagnosi precoce delle complicanze: shock infettivo-tossico (ITS),

v CID, insufficienza renale acuta (IRA), polmonite, ecc.;

v identificazione e trattamento adeguato delle comorbilità;

v in caso di condizioni di emergenza nei pazienti (ITS, DIC, sindrome da distress respiratorio, encefalopatia, insufficienza renale acuta, emodinamica instabile), trasferimento tempestivo dei pazienti all'unità di terapia intensiva.

Pertanto, l'AII è un ampio gruppo di malattie polietiologiche che si verificano con sindromi di danno del tratto gastrointestinale, intossicazione e disidratazione di varia gravità.

La diagnosi di AEI dovrebbe essere sindromica, non eziologica (con l'eccezione di colera e shigellosi).

Gli errori diagnostici nelle infezioni intestinali acute sono in gran parte dovuti alla comunanza dei sintomi clinici con molte malattie somatiche (appendicite acuta, ostruzione intestinale, infarto del miocardio, gravidanza ectopica, diabete mellito scompensato, ecc.).

La base del trattamento delle infezioni intestinali acute è la terapia reidratante con soluzioni di cristalloidi poliionici, somministrate per via orale o endovenosa. Il trattamento di forme complicate di infezioni intestinali acute (ITS, DIC, ARDS, insufficienza renale acuta, ecc.) in molti casi dovrebbe essere effettuato in unità di terapia intensiva. (7.8)

patogeno di infezione intestinale

Il metodo principale della diagnostica microbiologica e il "gold standard" della microbiologia è il metodo batteriologico.

Lo scopo del metodo batteriologico consiste nell'isolare una coltura pura del patogeno dal materiale di prova, accumulare una coltura pura e identificare questa coltura mediante un insieme di proprietà: morfologiche, tintorie, colturali, biochimiche, antigeniche, mediante la presenza di fattori di patogenicità, tossigenicità e determinarne la sensibilità ai farmaci antimicrobici e ai batteriofagi.

Il metodo di ricerca batteriologica comprende:

1. inoculazione del materiale di prova in terreni nutritivi

2. isolamento in coltura pura

3. identificazione dei microrganismi (determinazione dell'appartenenza a una specie).

L'isolamento e l'identificazione di colture pure di batteri aerobi e anaerobi comporta i seguenti studi:

Fase I (lavorare con materiale nativo)

Scopo: ottenere colonie isolate

1. La microscopia preliminare dà un'idea approssimativa della microflora

2. Preparazione del materiale per lo studio (diluizione con soluzione isotonica di NaCl, ecc.)

3. Semina su terreno nutritivo denso per ottenere colonie isolate

4. Incubazione a temperatura ottimale, più spesso 37°C, per 18-24 ore

II stadio

Scopo: ottenere una cultura pura

1. Studio macroscopico colonie in luce trasmessa e riflessa (caratteristica della dimensione, forma, colore, trasparenza, consistenza, struttura, contorno, superficie delle colonie).

2. Esame microscopico delle colonie isolate

3. Test di aerotolleranza (per confermare la presenza di anaerobi stretti nel materiale di prova).

4. Semina di colonie caratteristiche di una determinata specie su terreni di accumulo di coltura pura o terreni elettivi e incubazione in condizioni ottimali.

Fase III

Scopo: Identificazione della coltura pura isolata

1. Per identificare la coltura isolata da un complesso di proprietà biologiche, si studia quanto segue:

morfologia e proprietà tintorie

proprietà culturali (carattere di crescita sui mezzi nutritivi)

proprietà biochimiche (attività enzimatica dei microrganismi, glicolitica, proteolitica e altre attività)

Proprietà sierologiche (antigeniche)

Proprietà virulente (capacità di produrre fattori di patogenicità: tossine, enzimi, fattori di difesa e di aggressione)

patogenicità per gli animali

fagolizzabilità (sensibilità ai batteriofagi diagnostici)

sensibilità agli antibiotici

Altre proprietà individuali

Fase IV (Conclusione)

Secondo le proprietà studiate, viene fatta una conclusione sulla cultura isolata

La prima fase della ricerca. Lo studio del materiale patologico inizia con la microscopia. La microscopia di materiale nativo colorato consente di stabilire approssimativamente la composizione del paesaggio microbico dell'oggetto studiato, alcune caratteristiche morfologiche dei microrganismi. I risultati della microscopia del materiale nativo determinano in gran parte il corso di ulteriori ricerche e successivamente vengono confrontati con i dati ottenuti durante l'inoculazione sui terreni nutritivi.

Con un contenuto sufficiente di microrganismi patogeni nel campione, l'inoculazione viene effettuata su terreni nutritivi densi (per ottenere colonie isolate). Se ci sono pochi batteri nel materiale di prova, l'inoculo viene effettuato su terreni di arricchimento di nutrienti liquidi. I terreni nutritivi sono selezionati in base alle esigenze dei microrganismi.

La coltivazione di microrganismi è possibile solo creando condizioni ottimali per la loro attività vitale e osservando le regole che escludono la contaminazione (contaminazione accidentale da parte di microbi estranei) del materiale di prova. Le condizioni artificiali che escludono la contaminazione della coltura da parte di altre specie possono essere create in una provetta, un pallone o una capsula di Petri. Tutti gli utensili e i terreni nutritivi devono essere sterili e, dopo l'inoculazione del materiale microbico, protetti dalla contaminazione esterna, che si ottiene utilizzando tappi o tappi e coperchi metallici. Le manipolazioni con il materiale di prova devono essere eseguite nella zona di fiamma di una lampada ad alcool per escludere la contaminazione del materiale dall'ambiente esterno, nonché per rispettare le norme di sicurezza.

L'inoculo del materiale sui terreni nutritivi deve essere effettuato entro e non oltre 2 ore dal momento della loro raccolta.

La seconda fase della ricerca. Studio delle colonie e isolamento delle colture pure. Dopo un giorno di incubazione, le colonie crescono sulle piastre e al primo colpo la crescita è continua e nelle successive colonie isolate. Una colonia è un insieme di microbi della stessa specie che sono cresciuti da una singola cellula. Poiché il materiale è molto spesso una miscela di microbi, crescono diversi tipi di colonie. Diverse colonie sono contrassegnate con una matita, delineandole con un cerchio dal lato del fondo e studiandole (Tabella 12). Prima di tutto, studia le colonie ad occhio nudo: segni macroscopici. Si osserva la capsula (senza aprirla) dal basso in luce trasmessa, si nota la trasparenza delle colonie (trasparente, se non intrappola la luce; traslucida, se intrappola parzialmente la luce; opaca, se la luce non passa attraverso la colonia), misurare (in mm) la dimensione delle colonie. Quindi studiano le colonie dal lato del coperchio, notano la forma (regolare rotonda, irregolare, piatta, convessa), la natura della superficie (liscia, lucida, opaca, ruvida, rugosa, umida, secca, mucosa), il colore (incolore, colorato).

Tabella 12. Schema dello studio delle colonie

Nota: gli elementi 5-7 sono studiati con un microscopio a basso ingrandimento o sotto una lente d'ingrandimento.

Puoi vedere ancora meglio la differenza tra le colonie quando le ingrandisci. Per fare ciò si pone una capsula chiusa capovolta su un tavolo portaoggetti, si abbassa leggermente il condensatore, si utilizza un piccolo ingrandimento dell'obiettivo (x8), si sposta la capsula, si studiano i segni microscopici nelle colonie: la natura del bordo (liscio, ondulato, seghettato, smerlato), struttura (omogenea, granulosa, fibrosa, omogenea o diversa al centro e lungo la periferia).

Successivamente, viene studiata la morfologia delle cellule microbiche delle colonie. Per fare ciò, si effettuano degli strisci da una parte di ciascuna delle colonie contrassegnate, colorate secondo Gram. Nel prelevare le colonie prestare attenzione alla consistenza (secca, se la colonia si sgretola ed è difficile da prelevare; molle, se si preleva facilmente sull'ansa; viscida, se la colonia raggiunge l'ansa; dura, se parte della colonia non viene preso dal ciclo, solo l'intera colonia può essere rimossa) .

Quando si visualizzano gli strisci, si stabilisce che la colonia è rappresentata da un tipo di microbo, pertanto è possibile isolare colture pure di batteri. Per fare questo, dalle colonie studiate, la risemina viene eseguita su uno slant agar. Quando si effettua la risemina dalle colonie, è necessario prestare attenzione a prelevare esattamente le colonie previste, senza toccare l'anello delle colonie vicine. Le provette vengono firmate e incubate in termostato a 37°C per 24 ore.

La terza fase della ricerca. Identificazione della coltura isolata. Identificazione dei microbi - determinazione della posizione sistematica della coltura isolata dal materiale alla specie e variante. La prima condizione per l'affidabilità dell'identificazione è la purezza incondizionata della cultura. Per identificare i microbi viene utilizzata una serie di segni: morfologici (forma, dimensione, presenza di flagelli, capsule, spore, disposizione reciproca in uno striscio), tintoriali (relazione con la colorazione di Gram o altri metodi), chimici (rapporto guanina + citosina in una molecola di DNA), colturale (esigenze nutrizionali, condizioni di coltivazione, velocità e natura della crescita su vari mezzi nutritivi), enzimatico (scissione di varie sostanze con formazione di prodotti intermedi e finali), sierologico (struttura antigenica, specificità), biologico ( virulenza per gli animali, tossigenicità, allergenicità, effetto degli antibiotici, ecc.).

Per la differenziazione biochimica, studiano la capacità dei batteri di fermentare i carboidrati con la formazione di prodotti finali intermedi, la capacità di degradare proteine ​​e peptoni e studiano gli enzimi redox.

Per lo studio degli enzimi saccarolitici le colture isolate vengono inoculate in provette con terreni semiliquidi contenenti lattosio, glucosio e altri carboidrati e alcoli poliidrici. Sui terreni semiliquidi, l'inoculo viene effettuato mediante iniezione nella profondità del terreno. Quando si semina per iniezione, la provetta con il mezzo viene tenuta inclinata, il tappo viene rimosso e il bordo della provetta viene bruciato. Il materiale viene prelevato con un'ansa sterile e con esso una colonna di mezzo nutritivo viene perforata quasi fino in fondo.

Per la determinazione degli enzimi proteolitici la coltura isolata viene inoculata in acqua peptonata o BCH. Per fare questo, prendono una provetta con l'inoculo più vicino a se stessi e una provetta con il mezzo - più lontano da se stessi. Entrambe le provette vengono aperte contemporaneamente, catturando i loro tappi con il mignolo e il bordo del palmo, i bordi delle provette vengono bruciati, una piccola coltura viene catturata con un'ansa raffreddata calcinata e trasferita nella seconda provetta, triturata in un mezzo liquido sulla parete della provetta e lavato via con il mezzo.

Durante la semina e la risemina, occorre prestare attenzione al rispetto delle regole di sterilità, al fine di non contaminare le proprie colture con microflora estranea, nonché di non inquinare l'ambiente. Le provette vengono etichettate e poste in un termostato per l'incubazione alla temperatura di 37°C per un giorno.

Conclusione

Contabilizzazione dei risultati. Conclusione della ricerca. Si tiene conto dei risultati dell'identificazione e, sulla base della totalità dei dati ottenuti, sulla base della classificazione e delle caratteristiche dei ceppi tipo descritti nel manuale (Bergy's guide, 1994-1996), si determina il tipo di colture isolate.